【摘要】：公豬精液品質直接影響母豬受胎率、產仔數及后代質量,對豬場生產性能和經濟效率至關重要。有研究報道,5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因缺陷會引起機體同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高,誘導產生氧化應激,并導致精子發(fā)生障礙及不育,是葉酸與Hcy代謝中的重要酶,對于調節(jié)細胞內的葉酸水平、DNA合成和甲基化具有重要作用。本論文旨在建立和檢測公豬精液和血漿Hcy含量、精漿過氧化氫(hydrogen peroxide,H_2O_2)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,研究MTHFR基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與不同品種公豬精漿中的H_2O_2水平和MDA水平的相關關系,以期篩選公豬精子MTHFR基因的SNP位點作為早期預警公豬精液品質的生物標志,為公豬站提前淘汰劣質公豬提供理論依據。主要研究結果如下:1)公豬精子Hcy含量與液品質的關系:試驗選取健康的杜洛克、長白、大白49頭,根據記錄的精子密度、有效精子數和精子活力將49頭公豬分為精液品質優(yōu)(精子活力80%且精子畸形率10%)和差(精子活力70%或精子畸形率20%)2組。其中精液品質優(yōu)的公豬33頭,差的16頭。精液品質差的組精子密度、有效精子數和精子活力均顯著低于精液品質優(yōu)的組公豬(P0.01),而精子畸形率顯著高于精液品質優(yōu)的組公豬(P0.01)。利用高效液相色譜法檢測血漿和精子的Hcy水平,并分析其與公豬精液品質的關聯性。結果表明,精液品質差的組公豬精子Hcy含量顯著高于精液品質優(yōu)的組公豬(P0.01),但血漿Hcy含量無顯著差異(P0.05)。2)公豬精子MTHFR基因多態(tài)性與精液品質的關系:根據公豬站記錄選取采樣前3個月公豬精液利用率為100%的公豬中精液品質最好(主要是精子活力高和畸形率低,精子活力90%和精子畸形率5%)的公豬20頭,以及利用率小于60%的公豬中精液品質最差(主要是精子活力低和畸形率高,精子活力75%和精子畸形率15%)的公豬20頭。分別采樣提取精子DNA和擴增MTHFR外顯子片段。然后將40頭公豬各片段的PCR原液混合,通過一代測序技術,鑒定公豬精子MTHFR外顯子上的SNP位點。結果表明:公豬精子MTHFR基因外顯子上共存在13個SNP位點,其中兩個導致編碼氨基酸改變;與人的MTHFR基因的SNP位點相比,有7個位點是一致的,沒有發(fā)現與人不育癥相關的MTHFR 677CT的相似位點。采集945頭杜洛克公豬、459頭長白和86頭大白公豬的精液樣品,利用高通量SNP分型技術對1490頭公豬精子樣品的MTHFR的基因SNP位點進行檢測,并與精液量、精子密度、總精子數、有效精子數、精子活力、精子畸形率等指標進行了關聯分析。結果表明:杜洛克公豬c.450CT位點與精子活力顯著相關(P0.05);c.294CT位點與總精子數和有效精子數都顯著相關(P0.05)。長白公豬c.450CT位點與精液量顯著相關;c.450CT位點與精子密度顯著相關;c.1278GA、c.1041GA、c.570CT和c.414CG位點不僅與精子密度顯著相關,還與精子畸形率顯著相關(P0.05)。沒有發(fā)現SNP位點與大白公豬精液品質相關。對長白公豬符合哈達溫伯格定律的c.1485AG、c.1287AG、c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、和c.414CG的6個位點和大白公豬符合哈代溫伯格定律的c.1485AG、c.1287AG、c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、c.450CT、c.414CG的7個位點進行基因連鎖不平衡分析。結果表明:長白公豬精子MTHFR外顯子上的6個SNP位點構成2個單倍型模塊,模塊1的c.1485AG和c.1287AG位點處于強連鎖不平衡狀態(tài)(D’0.8,r~20.33);模塊2的c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、和c.414CG的4個SNP兩兩之間均處于強連鎖不平衡狀態(tài)(D’0.8,r~20.33);大白公豬精子MTHFR外顯子上的7個SNP構成1個單倍型模塊,模塊中的c.1485AG、c.1287AG、c.1278GA、c.1041GA、c.570CT的5個SNP位點兩兩之間均處于強連鎖不平衡狀態(tài)(D’0.8,r~20.33)。3)試驗選取170頭長白公豬,檢測了精漿中的H_2O_2和MDA水平,并與MTHFR基因的SNP位點進行關聯性分析。結果表明:長白公豬MTHFR的c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、c.414CG和c.294CT位點不同基因型精漿中的H_2O_2水平和MDA水平存在顯著性差異。綜上所述,本研究主要結論如下:精液品質差組公豬精子Hcy含量顯著高于精液品質優(yōu)組公豬,但血漿Hcy含量無顯著差異。長白公豬MTHFR c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、c.414CG和c.294CT位點不同基因型不僅與精液品質存在顯著性差異,還與精漿中的H_2O_2水平和MDA水平存在顯著性差異,因此這些位點的多態(tài)性可能作為潛在的預測長白公豬精液品質的生物標記。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S828.3
【圖文】：

圖 1-2 高效液相法測定 Hcy 標準曲線Fig 1-2 Hcy standard curve was determined by HPLC子 Hcy 含量與精液品質關聯分析精液品質差和精液品質優(yōu)的公豬共 49 頭，檢測各組公豬發(fā)現，精液品質差組公豬精子密度、有效精子數和精子活公豬（P < 0.01），而精子畸形率顯著高于精液品質優(yōu)組公質組公豬機體 Hcy 含量檢測發(fā)現，精液品質差組公豬精質優(yōu)組公豬（P < 0.05），但血漿 Hcy 含量無顯著差異（

圖 1-1 標準品（A）和精子樣品（B）中 Hcy 色譜圖 1-1 Hcy chromatogram of standard (A) and sperm samples (B圖 1-2 高效液相法測定 Hcy 標準曲線Fig 1-2 Hcy standard curve was determined by HPLC Hcy 含量與精液品質關聯分析

×109個/次 53.29±29.38 69.74±23.29 0.06有效精子數, ×109個/次 23.27±16.52B61.02±20.66A<0.01精子活力, % 65.02[37.03-76.45]B93.11[92.01-94.00]A<0.01精子畸形率, % 29.12[24.21-36.31]A6 .21[4.05-8.09]B<0.01Hcy 含量 Hcy concentration血漿 Hcy, μmol/L 32.04±18.04 35.13±17.69 0.41精子 Hcy, ×10-9μmol/L 0.17[0.14-0.27]a0.14[0.11-0.18]b<0.05注：1精液品質差為公豬精子活力 < 70%或畸形率 > 20%；2精液品質優(yōu)為公豬精子活力 > 80%且畸形率 < 10%；3顯著水平為 P < 0.05，極顯著水平為 P < 0.01。Poor semen quality is motility<70% or abnormal rate>20%; excellent semen quality is motility>80%and abnormal rate<10%; Significant level, P<0.05; marked significant level, P<0.01.如圖 1-3 所示，對試驗公豬精子 Hcy 含量與精液品質參數進行回歸分析發(fā)現，精子 Hcy 含量與精子活力呈負相關（Y=-91.48X+98.546; r=0.545，P<0.01），但與精子畸形率相關性不顯著（Y=9.4838X+11.836; r=0.098，P=0.50）。

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