【摘要】：公豬精液品質(zhì)直接影響母豬受胎率、產(chǎn)仔數(shù)及后代質(zhì)量,對(duì)豬場(chǎng)生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效率至關(guān)重要。有研究報(bào)道,5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因缺陷會(huì)引起機(jī)體同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高,誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激,并導(dǎo)致精子發(fā)生障礙及不育,是葉酸與Hcy代謝中的重要酶,對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的葉酸水平、DNA合成和甲基化具有重要作用。本論文旨在建立和檢測(cè)公豬精液和血漿Hcy含量、精漿過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H_2O_2)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,研究MTHFR基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與不同品種公豬精漿中的H_2O_2水平和MDA水平的相關(guān)關(guān)系,以期篩選公豬精子MTHFR基因的SNP位點(diǎn)作為早期預(yù)警公豬精液品質(zhì)的生物標(biāo)志,為公豬站提前淘汰劣質(zhì)公豬提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1)公豬精子Hcy含量與液品質(zhì)的關(guān)系:試驗(yàn)選取健康的杜洛克、長(zhǎng)白、大白49頭,根據(jù)記錄的精子密度、有效精子數(shù)和精子活力將49頭公豬分為精液品質(zhì)優(yōu)(精子活力80%且精子畸形率10%)和差(精子活力70%或精子畸形率20%)2組。其中精液品質(zhì)優(yōu)的公豬33頭,差的16頭。精液品質(zhì)差的組精子密度、有效精子數(shù)和精子活力均顯著低于精液品質(zhì)優(yōu)的組公豬(P0.01),而精子畸形率顯著高于精液品質(zhì)優(yōu)的組公豬(P0.01)。利用高效液相色譜法檢測(cè)血漿和精子的Hcy水平,并分析其與公豬精液品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明,精液品質(zhì)差的組公豬精子Hcy含量顯著高于精液品質(zhì)優(yōu)的組公豬(P0.01),但血漿Hcy含量無(wú)顯著差異(P0.05)。2)公豬精子MTHFR基因多態(tài)性與精液品質(zhì)的關(guān)系:根據(jù)公豬站記錄選取采樣前3個(gè)月公豬精液利用率為100%的公豬中精液品質(zhì)最好(主要是精子活力高和畸形率低,精子活力90%和精子畸形率5%)的公豬20頭,以及利用率小于60%的公豬中精液品質(zhì)最差(主要是精子活力低和畸形率高,精子活力75%和精子畸形率15%)的公豬20頭。分別采樣提取精子DNA和擴(kuò)增MTHFR外顯子片段。然后將40頭公豬各片段的PCR原液混合,通過(guò)一代測(cè)序技術(shù),鑒定公豬精子MTHFR外顯子上的SNP位點(diǎn)。結(jié)果表明:公豬精子MTHFR基因外顯子上共存在13個(gè)SNP位點(diǎn),其中兩個(gè)導(dǎo)致編碼氨基酸改變;與人的MTHFR基因的SNP位點(diǎn)相比,有7個(gè)位點(diǎn)是一致的,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與人不育癥相關(guān)的MTHFR 677CT的相似位點(diǎn)。采集945頭杜洛克公豬、459頭長(zhǎng)白和86頭大白公豬的精液樣品,利用高通量SNP分型技術(shù)對(duì)1490頭公豬精子樣品的MTHFR的基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),并與精液量、精子密度、總精子數(shù)、有效精子數(shù)、精子活力、精子畸形率等指標(biāo)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明:杜洛克公豬c.450CT位點(diǎn)與精子活力顯著相關(guān)(P0.05);c.294CT位點(diǎn)與總精子數(shù)和有效精子數(shù)都顯著相關(guān)(P0.05)。長(zhǎng)白公豬c.450CT位點(diǎn)與精液量顯著相關(guān);c.450CT位點(diǎn)與精子密度顯著相關(guān);c.1278GA、c.1041GA、c.570CT和c.414CG位點(diǎn)不僅與精子密度顯著相關(guān),還與精子畸形率顯著相關(guān)(P0.05)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)與大白公豬精液品質(zhì)相關(guān)。對(duì)長(zhǎng)白公豬符合哈達(dá)溫伯格定律的c.1485AG、c.1287AG、c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、和c.414CG的6個(gè)位點(diǎn)和大白公豬符合哈代溫伯格定律的c.1485AG、c.1287AG、c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、c.450CT、c.414CG的7個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因連鎖不平衡分析。結(jié)果表明:長(zhǎng)白公豬精子MTHFR外顯子上的6個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)成2個(gè)單倍型模塊,模塊1的c.1485AG和c.1287AG位點(diǎn)處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)(D’0.8,r~20.33);模塊2的c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、和c.414CG的4個(gè)SNP兩兩之間均處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)(D’0.8,r~20.33);大白公豬精子MTHFR外顯子上的7個(gè)SNP構(gòu)成1個(gè)單倍型模塊,模塊中的c.1485AG、c.1287AG、c.1278GA、c.1041GA、c.570CT的5個(gè)SNP位點(diǎn)兩兩之間均處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)(D’0.8,r~20.33)。3)試驗(yàn)選取170頭長(zhǎng)白公豬,檢測(cè)了精漿中的H_2O_2和MDA水平,并與MTHFR基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果表明:長(zhǎng)白公豬MTHFR的c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、c.414CG和c.294CT位點(diǎn)不同基因型精漿中的H_2O_2水平和MDA水平存在顯著性差異。綜上所述,本研究主要結(jié)論如下:精液品質(zhì)差組公豬精子Hcy含量顯著高于精液品質(zhì)優(yōu)組公豬,但血漿Hcy含量無(wú)顯著差異。長(zhǎng)白公豬MTHFR c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、c.414CG和c.294CT位點(diǎn)不同基因型不僅與精液品質(zhì)存在顯著性差異,還與精漿中的H_2O_2水平和MDA水平存在顯著性差異,因此這些位點(diǎn)的多態(tài)性可能作為潛在的預(yù)測(cè)長(zhǎng)白公豬精液品質(zhì)的生物標(biāo)記。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S828.3
【圖文】：

圖 1-2 高效液相法測(cè)定 Hcy 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1-2 Hcy standard curve was determined by HPLC子 Hcy 含量與精液品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析精液品質(zhì)差和精液品質(zhì)優(yōu)的公豬共 49 頭，檢測(cè)各組公豬發(fā)現(xiàn)，精液品質(zhì)差組公豬精子密度、有效精子數(shù)和精子活公豬（P < 0.01），而精子畸形率顯著高于精液品質(zhì)優(yōu)組公質(zhì)組公豬機(jī)體 Hcy 含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，精液品質(zhì)差組公豬精質(zhì)優(yōu)組公豬（P < 0.05），但血漿 Hcy 含量無(wú)顯著差異（

圖 1-1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）和精子樣品（B）中 Hcy 色譜圖 1-1 Hcy chromatogram of standard (A) and sperm samples (B圖 1-2 高效液相法測(cè)定 Hcy 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1-2 Hcy standard curve was determined by HPLC Hcy 含量與精液品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析

×109個(gè)/次 53.29±29.38 69.74±23.29 0.06有效精子數(shù), ×109個(gè)/次 23.27±16.52B61.02±20.66A<0.01精子活力, % 65.02[37.03-76.45]B93.11[92.01-94.00]A<0.01精子畸形率, % 29.12[24.21-36.31]A6 .21[4.05-8.09]B<0.01Hcy 含量 Hcy concentration血漿 Hcy, μmol/L 32.04±18.04 35.13±17.69 0.41精子 Hcy, ×10-9μmol/L 0.17[0.14-0.27]a0.14[0.11-0.18]b<0.05注：1精液品質(zhì)差為公豬精子活力 < 70%或畸形率 > 20%；2精液品質(zhì)優(yōu)為公豬精子活力 > 80%且畸形率 < 10%；3顯著水平為 P < 0.05，極顯著水平為 P < 0.01。Poor semen quality is motility<70% or abnormal rate>20%; excellent semen quality is motility>80%and abnormal rate<10%; Significant level, P<0.05; marked significant level, P<0.01.如圖 1-3 所示，對(duì)試驗(yàn)公豬精子 Hcy 含量與精液品質(zhì)參數(shù)進(jìn)行回歸分析發(fā)現(xiàn)，精子 Hcy 含量與精子活力呈負(fù)相關(guān)（Y=-91.48X+98.546; r=0.545，P<0.01），但與精子畸形率相關(guān)性不顯著（Y=9.4838X+11.836; r=0.098，P=0.50）。

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本文編號(hào)：2779849