【摘要】：固有免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防線,宿主的模式識別受體能夠?qū)Σ≡嚓P(guān)分子模式進(jìn)行識別,進(jìn)而激活固有免疫系統(tǒng),最終釋放干擾素和炎癥因子等一系列細(xì)胞因子通過抗病毒或參與炎癥反應(yīng)等發(fā)揮作用。I型干擾素可以通過JAK/STAT通路激活數(shù)以百計(jì)的干擾素刺激基因(ISGs)轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而發(fā)揮抗病毒作用。而病毒也進(jìn)化出了許多對抗宿主抗病毒反應(yīng)的策略,尤其是對抗宿主的固有免疫系統(tǒng)。因此研究固有抗病毒免疫和病毒對固有免疫系統(tǒng)的抑制,對于基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用都有很大的意義。貓杯狀病毒(FCV)是杯狀病毒科,水瘡性病毒屬(Vesivirus)成員,感染貓后可引起上呼吸道疾病和急性口腔炎潰瘍,病情嚴(yán)重的,可引起感染貓的死亡。同病毒科的人諾如病毒是引起急性胃腸炎和腹瀉最重要的病原之一。目前還沒有對抗人諾如病毒的有效藥物和疫苗,主要原因是一直以來人諾如病毒的體外培養(yǎng)技術(shù)都不成熟。此外杯狀病毒與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用研究相對較少,FCV體外培養(yǎng)技術(shù)比較成熟,是目前研究人諾如病毒最好的模式病毒之一,研究FCV與固有免疫系統(tǒng)的關(guān)系對整個(gè)杯狀病毒科的研究都有很重要的意義。本研究首先應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選FCV感染CRFK細(xì)胞前后的差異表達(dá)蛋白,共篩選到差異蛋白429個(gè),其中229個(gè)蛋白表達(dá)量升高,有200個(gè)蛋白表達(dá)量降低;與固有免疫相關(guān)的蛋白有IFNAR1、IRF1、IRF9、IFI35、IFIT3、PKR和ISG15等,且這些蛋白表達(dá)量都發(fā)生了不同程度的下調(diào);其中IFNAR1為I型干擾素受體組分,IRF1為I型干擾素信號通路重要調(diào)控分子,該發(fā)現(xiàn)為FCV抑制I型干擾素通路研究奠定基礎(chǔ)。其次,通過IFN-α抗病毒試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)IFN-α不能夠抑制FCV復(fù)制,Western blot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明FCV感染后下調(diào)了IFNAR1在細(xì)胞表面的表達(dá)量,qRT-PCR、半定量PCR和Northern blot結(jié)果表明FCV感染后IFNAR1的mRNA表達(dá)量減少,最終發(fā)現(xiàn)FCV非結(jié)構(gòu)蛋白PP和p30可以抑制共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的表達(dá),且PP和p30轉(zhuǎn)染后可以使IFNAR1的mRNA表達(dá)量降低。此外,克隆了貓?jiān)碔RF1(Fe-IRF1),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Fe-IRF1后可以顯著抑制FCV的復(fù)制。雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果表明Fe-IRF1通過激活I(lǐng)型干擾素通路發(fā)揮抗病毒作用;Western blot結(jié)果表明FCV感染可以下調(diào)IRF1蛋白表達(dá)量;qRT-PCR結(jié)果表明FCV感染可以下調(diào)IRF1的mRNA表達(dá)量�？傊�,本研究應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法,篩選到FCV感染后下調(diào)表達(dá)的固有免疫相關(guān)蛋白IFNAR1、IRF1、IRF9、IFI35、IFIT3、PKR和ISG15等;FCV感染后可以通過下調(diào)IFNAR1的mRNA表達(dá),阻斷I型干擾素通路發(fā)揮作用;FCV感染后同時(shí)可以下調(diào)IRF1的mRNA水平,抑制I型干擾素通路發(fā)揮作用。最終FCV可以通過兩種方式抑制I型干擾素信號通路的抗病毒作用。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章度為 1.37-1.42 /cm3。V 對乙醚、氯仿以及溫和的洗滌劑不敏感，酸度為 pH=3 時(shí)不穩(wěn)定，pH=4-5 時(shí)穩(wěn)定即可使病毒喪失感染能力。1~2 mol/LNaCl 可以提高病毒的耐熱性，然而 MgCl2可(黃倩倩等., 2015)，2% NaOH 可以有效的滅活病毒，F(xiàn)CV 對干燥和紫外線也很敏

圖 1.1 FCV 病毒粒子模式圖（引自 viralzone 網(wǎng)站）Figure 1.1 Schematic of FCV Virion（cited from the viralzone website） FCV 基因組CV 的基因組為一條單股正鏈不分節(jié)段的 RNA 分子，大小在 7.7kb 左右，在其 5’端結(jié)合有接蛋白 VPg，VPg 之后是 5’-UTR，隨后是三個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF ORF1、ORF2 和 ORF3（圖 1.2）。CV 的 ORF1 位于基因組 RNA 的 5’端，起始位點(diǎn)是從第 20 位到第 5311 位核苷酸，是位R 后的第一個(gè) ORF，ORF1 編碼 FCV 的非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF1 首先翻譯出一個(gè) 200 kDa 的多隨后在蛋白酶聚合酶（Protease Polymerase, PP）的作用下能夠?qū)⒍嗑鄣鞍浊懈畛蓡为?dú)非，F(xiàn)CV 共有 7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，從左到右大小依次為 5.6 kDa、32 kDa、38.9 kDa、30.1 kDDa 和 75.7 kDa ，它們分別被命名為 p5.6、p32、p39(NTPase)、p30、p13（VPg）、p76（Pro-Po玉 等., 2010)(Sosnovtsev et al., 2002)。CV 的 ORF2 和 ORF3 分別編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白 VP1 和次要結(jié)構(gòu)蛋白 VP2。VP1 和 VP2 是基因組基因翻譯得到的。ORF2 編碼的衣殼蛋白前體大小約為 73 kDa，被 PP 切割成一a 大小的衣殼蛋白前導(dǎo)區(qū)和衣殼蛋白成熟區(qū) VP1，大量成熟的 VP1 加上少量 VP2 能夠與g 的病毒基因組共同組裝得到完整的有感染性的病毒粒子。

125 aa之間的位點(diǎn)進(jìn)行切割，除去N末端的124aa后形成62 kDa的成熟衣殼蛋白VP1(Ca 1992)，PP 對 VP1 蛋白前體的切割非�？�，只有當(dāng)切割被抑制的時(shí)候，VP1 蛋白前體才測到，例如在培養(yǎng)基中添加蛋白酶抑制劑，或者是在較高溫度條件下培養(yǎng) FCV 才能夠VP1 前體(Carter, 1989)。VP1 蛋白前體最早在病毒感染 2 h 就能夠檢測到，但是蛋白很快 62kDa 的成熟衣殼(Carter, 1989)。此外 VP1 還能夠在細(xì)胞內(nèi)被切割出一條 40 kDa 左右這種切割是依賴半胱天冬酶的，至于具體切割的機(jī)制和用途暫時(shí)還不明確(Carter et al., 19ts et al., 2003a)。成熟的 VP1 和 VP2 與基因組結(jié)合可以自動組裝成病毒粒子，實(shí)驗(yàn)室真核VP1 可以自動組裝成病毒樣粒子（Virus-like particle，VLP），但是這種 VLP 在形態(tài)和大小的病毒粒子有一些差異，它的表面是平滑的，并沒有杯狀的凹陷，不過這樣的 VLP 有原性，能和 FCV 陽性血清發(fā)生良好的反應(yīng)，同時(shí)在免疫家兔后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的，能和多株臨床分離的FCV流行毒株發(fā)生反應(yīng)，可以作為FCV的候選疫苗(Di Martino et 。據(jù)不同 FCV 病毒株之間的相似性，F(xiàn)CV 的衣殼蛋白 VP1 可分為六個(gè)區(qū)域：A、B、C、D區(qū)，以 FCV 2280 株為例，A 區(qū)位于 1-124 aa，也就是 VP1 前體被切割掉的 VP1 前導(dǎo)區(qū)， 125-397aa，B 區(qū)內(nèi)包含一個(gè)潛在的肉豆蔻化甘氨酸和 ATP/GTP 結(jié)合位點(diǎn)，C 區(qū)、E 區(qū)，分別位于 398-401 aa 和 427-524 aa 之間，他們含有中和抗原表位，F(xiàn) 區(qū)位于 525 aa～6，含有非中和抗原表位(Neill et al., 1991; Seal and Neill, 1995)（圖 1.3）。

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