【摘要】：微小隱孢子蟲是一種腸道寄生蟲,屬于頂復(fù)門原蟲,是導(dǎo)致全球腹瀉病的主要病原之一。對于隱孢子蟲病,缺乏有效的治療藥物,部分原因是隱孢子蟲與宿主細(xì)胞之間互作機(jī)制了解太少,為此,尋找微小隱孢子蟲黏附及入侵宿主細(xì)胞的相關(guān)分子顯得十分關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn),頂復(fù)門寄生蟲在入侵宿主細(xì)胞時(shí)是一個(gè)連續(xù)的過程,其必要條件是寄生蟲的多種分子(配體)與宿主細(xì)胞表面的分子(受體)結(jié)合,進(jìn)而入侵宿主細(xì)胞。肝素類糖胺聚糖分子是一類重要的黏附受體,其能夠顯著抑制蟲體對宿主細(xì)胞的黏附入侵。本研究中選取了與之前報(bào)道的TRAP蛋白家族里的TRAP-C1和TSP8結(jié)構(gòu)相似微小隱孢子蟲TSP7蛋白質(zhì)作為研究對象,對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位和相關(guān)黏附功能研究。首先通過生物信息學(xué)分析,合成一段特異性好、免疫原性強(qiáng)的多肽序列“361QISQWTDWSTC371”,分別偶聯(lián)至載體蛋白KLH和BSA上,分別用于免疫動物和ELISA檢測,制備了抗TSP7單克隆抗體。通過間接免疫熒光的方法,利用單抗對TSP7蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。通過Western blot的方法,對子孢子中的TSP7天然蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。通過熒光定量PCR的方法,分別提取微小隱孢子蟲卵囊、子孢子及細(xì)胞內(nèi)不同時(shí)期的總RNA,對TSP7基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。為了進(jìn)一步研究TSP7的相關(guān)黏附功能,利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白質(zhì)TSP7-GST,通過Western blot、間接免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)三種試驗(yàn)方法分析TSP7-GST與HCT-8細(xì)胞的黏附情況。通過重組TSP7-GST蛋白質(zhì)與肝素磁珠結(jié)合試驗(yàn)、肝素鈉鹽抑制該重組蛋白質(zhì)與肝素磁珠結(jié)合試驗(yàn)及肝素鈉鹽抑制重組蛋白與HCT-8的結(jié)合試驗(yàn),驗(yàn)證硫化肝素作為該重組蛋白結(jié)合HCT-8的主要受體。最后,通過熒光定量PCR的方法評價(jià)抗TSP7單抗阻斷蟲體入侵HCT-8的效果。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明TSP7蛋白質(zhì)N端為信號肽,C端為跨膜區(qū),含有3個(gè)TSP1結(jié)構(gòu)域,1個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域,4個(gè)肝素結(jié)合基序。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TSP7蛋白質(zhì)位于微小隱孢子蟲子孢子與裂殖子表膜,且能夠與微小隱孢子蟲已知膜蛋白Gp15共定位。Western blot結(jié)果表明anti-TSP7單抗能夠特異性識別大小為125 KDa的蟲體天然蛋白。以蟲體Cp18S為內(nèi)參,進(jìn)行熒光定量PCR,結(jié)果表明TSP7基因在各時(shí)期均有轉(zhuǎn)錄,在蟲體入侵HCT-8細(xì)胞12 h時(shí)轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高。通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化出可溶性重組蛋白質(zhì)TSP7-GST,利用流式細(xì)胞術(shù)、間接免疫熒光、細(xì)胞ELISA分析該重組蛋白質(zhì)與HCT-8的結(jié)合情況,結(jié)果表明與對照組(標(biāo)簽蛋白質(zhì)GST)相比,TSP7-GST能夠與HCT-8結(jié)合,結(jié)合曲線呈劑量依賴性和可飽和性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TSP7-GST能夠與肝素磁珠結(jié)合,且這種結(jié)合受到肝素鈉鹽的競爭性抑制,表明這種結(jié)合是特異性的,而且不同濃度肝素鈉鹽能夠抑制TSP7-GST與HCT-8細(xì)胞的結(jié)合。最后,單抗阻斷結(jié)果表明,單抗能夠顯著阻斷蟲體入侵HCT-8細(xì)胞,并呈現(xiàn)劑量依賴性,當(dāng)抗體濃度達(dá)到100μg/m L時(shí),抑制率達(dá)到48%。綜上,TSP7蛋白質(zhì)在蟲體與宿主細(xì)胞的互作方面扮演重要角色,可通過結(jié)合HCT-8表面的硫化肝素介導(dǎo)蟲體的黏附和感染,有望成為防治隱孢子蟲病的一個(gè)潛在的藥物靶標(biāo)及疫苗候選抗原。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.723
【圖文】：

TSP7 第 1-34 個(gè)氨基酸為信號肽，編碼區(qū)含有 3 個(gè) TSP1 結(jié)構(gòu)域，1 個(gè)EGF-like 結(jié)構(gòu)域。用網(wǎng)站 swissmodel.expasy.org 對 Cgd5_4470 空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，圖 1.3 所示，紅色括號、紅色箭頭所示分別為 Loop 區(qū)多肽序列和三維結(jié)構(gòu)模型，方框?yàn)樗x序列的 B 細(xì)胞表位預(yù)測值。多肽序列為：361QISQWTDWSTC371。圖 1.1 微小隱孢子蟲 TSP7 結(jié)構(gòu)示意圖Fig1.1 Sche

P7 空間結(jié)構(gòu)，三維模型及 B 所選擇的多肽序列，方框?yàn)閒 TSP7 spatial structure, 3D mows indicate the selected polypted value of the B cell epitope ，偶聯(lián)的多肽-BSA 經(jīng) 10%SD其分子量變大，其相對分子

圖 1.2 TSP7 空間結(jié)構(gòu)，三維模型及 B 細(xì)胞表位分析色的括號及箭頭所示為所選擇的多肽序列，方框?yàn)樵撔蛄?B 細(xì)胞表位預(yù)測Fig 1.2 Analysis of TSP7 spatial structure, 3D model and B cell epitopeThe red brackets and arrows indicate the selected polypeptide sequence, and the is the predicted value of the B cell epitope of the sequence.3.2 多肽偶聯(lián)的鑒定利用 MBS 偶聯(lián)方法，偶聯(lián)的多肽-BSA 經(jīng) 10%SDS-PAGE 分析，如圖 1.3，偶聯(lián)至載體蛋白上后其分子量變大，其相對分子質(zhì)量為 100 KDa 左右， BSA 偶聯(lián)成功。

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本文編號：2778861