【摘要】：豬δ冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒,主要引起仔豬腹瀉,嘔吐和脫水。PDCoV自2012年在中國香港首次報(bào)道以來在世界多國迅速擴(kuò)散,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病毒在近幾年新發(fā),尚無有效的疫苗及商品化的檢測(cè)、診斷方法和試劑盒。本研究旨在利用表達(dá)純化PDCoV N蛋白建立一種檢測(cè)該病原抗體的間接ELISA檢測(cè)方法,為臨床上檢測(cè)、診斷PDCoV感染提供有效的依據(jù)。為獲得高純度PDCoV N蛋白,本研究從PDCoV cDNA中利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得N基因的核酸,目的片段經(jīng)酶切處理后克隆至原核表達(dá)載體pET-30a(+)中,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR鑒定及測(cè)序驗(yàn)證后命名為rPDCoV-N。將重組質(zhì)粒rPDCoV-N轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析及Western-blot鑒定。結(jié)果表明,目的蛋白在表達(dá)體系中被成功表達(dá),其蛋白分子量大小為50.4 KDa。此后,對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度及表達(dá)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化,并采用鎳柱親和層析純化目的蛋白。結(jié)果表明,本研究獲得了大量高純度PDCoV N蛋白,可用作本研究ELISA的包被抗原。采用純化的重組N蛋白為包被抗原,PDCoV感染的陽性豬血清為一抗,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗,建立了檢測(cè)PDCoV N蛋白抗體的間接ELISA方法。此后,本研究從抗原包被濃度、包被溫度、封閉液濃度及封閉時(shí)間、一抗稀釋度及孵育時(shí)間、二抗稀釋度及孵育時(shí)間、顯色時(shí)間等方面對(duì)ELISA檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化,獲得了如下最佳反應(yīng)條件:抗原的最佳包被量為100 ng/孔,抗原的最佳包被溫度及時(shí)間為4℃、1h,最佳封閉物濃度、溫度及時(shí)間分別為2.5%BSA、37℃、1h,一抗最佳稀釋度為1:25,一抗最佳孵育時(shí)間為37℃1.5h,二抗最佳稀釋濃度為1:5000,二抗的最佳孵育時(shí)間為1.5h,最佳顯色時(shí)間為5min。由此可見,本研究已初步建立了基于PDCoV-N蛋白的間接ELISA抗體檢測(cè)方法,為臨床上對(duì)豬群PDCoV感染的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)保障。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651
【圖文】：

圖 1-1 病毒粒子電鏡圖Fig.1-1 Electron micrographs of PDCoVPDCoV 是有囊膜單股正鏈 RNA 病毒，其基因組全長約為 25.4 kb[14]，成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白、4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和 3 個(gè)輔助蛋白[15, 16]，具有 5’端帽oly（A）尾巴結(jié)構(gòu)，在已知冠狀病毒中其基因組最小[16]。PDCoV 的基包含 5’非翻譯區(qū)（UTR）、ORF1a、ORF1b、表面纖突蛋白（Spike, 蛋白（Envelope, E）、膜蛋白（Membrane, M）、非結(jié)構(gòu)蛋白 6（Nsp白（Nucleocapsid, N）非結(jié)構(gòu)蛋白 7（Nsp7）和 3’-UTR[17]。最近，也道在 Nsp7 中又新發(fā)現(xiàn)一個(gè)蛋白 Nsp7a[18]（圖 1-2）。其中，ORF1b 占編碼兩個(gè)重疊復(fù)制多聚蛋白的基因組的三分之二，編碼兩個(gè)病毒聚蛋白 pp1a 和 pplab[11]，它們被蛋白酶水解切割成 15 個(gè)成熟的非結(jié)構(gòu)sps），其中，主要是與病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白酶包括 Nsp3（木瓜蛋）、Nsp5（糜蛋白酶，3CLpro）、Nsp12（RNA 依賴的 RNA 聚合

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位論文顆粒的裝配與 M 蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)域是密不可分的[22]。N 蛋白主要在病毒復(fù)制的初期產(chǎn)生，在病毒復(fù)制和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用[23]。輔助蛋白 NS6 主要位于基因組中結(jié)構(gòu)蛋白 M 和 N之間[24]，在冠狀病毒復(fù)制的早期階段發(fā)揮作用，可以激活細(xì)胞自噬[25]。而 NS7 主要位于 N 基因內(nèi)的另一 ORF 中，編碼 200 個(gè)氨基酸[26]。預(yù)測(cè)的輔助蛋白質(zhì)廣泛分布于整個(gè)冠狀病毒的基因組中并且具有物種特異性。先前有研究表明，冠狀病毒中所含有的輔助蛋白雖然對(duì)于體外病毒復(fù)制是非必需的，但是冠狀病毒中輔助蛋白的存在對(duì)于病毒的致病機(jī)制和體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)[27, 28]。兩個(gè)輔助基因即 Nsp6 和 Nsp7分別位于 N基因的上游和一段。Nsp7a 由具有非規(guī)范轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的單獨(dú)的亞基因組 mRNA 編碼，但其作用并不清楚。

冠狀病毒中所含有的輔助蛋白雖然但是冠狀病毒中輔助蛋白的存在對(duì)于病毒的致[27, 28]。兩個(gè)輔助基因即 Nsp6 和 Nsp7分別位于具有非規(guī)范轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的單獨(dú)的亞基因組 m圖 1-2 PDCoV的基因組結(jié)構(gòu)Fig.1-2 The genomic structure of PDCoV

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