【摘要】：為了探尋c AMP-PKA信號通路介導(dǎo)的食欲素A對綿羊卵巢黃體化顆粒細(xì)胞分泌孕酮的影響。本試驗(yàn)以綿羊卵巢為研究對象,抽取卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),以HE染色和卵泡刺激素受體(FSHR)免疫熒光染色對所培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行鑒定后,對顆粒細(xì)胞聯(lián)合添加LH(2.5IU/ml)、FSH(2.5IU/ml)、E2(1ug/mL)處理24h使其黃體化。添加10 nmol/L和50 nmol/L的食欲素A處理24 h收取細(xì)胞上清,運(yùn)用ELISA方法檢測綿羊卵巢黃體化顆粒細(xì)胞上清液中孕酮濃度;收集細(xì)胞,ELISA檢測綿羊卵巢黃體化顆粒細(xì)胞中cAMP的濃度。在卵巢黃體化顆粒細(xì)胞中添加添加不同濃度的食欲素受體抑制劑(Almorexant)(10 nmol/L,100 nmol/L,1μmol/L)孵育2 h,添加不同濃度(10 nmol/L,50 nmol/L)的食欲素A孵育24 h收取細(xì)胞上清,運(yùn)用ELISA方法檢測細(xì)胞裂解上清中c AMP濃度變化;western blot檢測細(xì)胞中St AR,以及PKA蛋白的表達(dá)量。分別添加Almorexant,食欲素受體激活劑(Orexin Receptor Agonist),PKA抑制劑(H-89),分別檢測細(xì)胞中StAR以及PKA蛋白表達(dá)量的變化,以及細(xì)胞中cAMP的濃度變化。結(jié)果表明,HE染色鏡下可見梭形或不規(guī)則星形的卵巢黃體化顆粒細(xì)胞,胞核與胞漿著色均勻,細(xì)胞核呈藍(lán)紫色,胞漿呈淡粉色。免疫熒光結(jié)果顯示FSHR呈陽性表達(dá)。綿羊卵巢黃體化顆粒細(xì)胞添加食欲素A,同一時(shí)間孕酮分泌量隨食欲素濃度的增加呈逐漸升高然后下降的趨勢,且濃度10 nmol/L時(shí)孕酮分泌量達(dá)到最高;添加同一濃度的食欲素A,隨著作用時(shí)間的延長孕酮分泌量呈逐漸升高然后下降的趨勢,且在24 h時(shí)分泌量達(dá)到最高。添加Almorexant與對照組相比cAMP的濃度顯著降低(P0.01)。通過檢測Almorexant、Orexin Receptor Agonist、H-89對卵巢黃體化顆粒細(xì)胞內(nèi)PKA及St AR蛋白表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn),與對照組相比,orexin A組St AR和PKA蛋白的表達(dá)量顯著升高(P0.05);在添加食欲素受體激活劑Orexin Receptor Agonist后再添加orexin A,黃體化綿羊顆粒細(xì)胞中St AR和PKA蛋白的表達(dá)量顯著增加(P0.001);添加抑制劑組黃體化綿羊顆粒細(xì)胞中St AR和PKA蛋白的表達(dá)量顯著減少;添加H-89組顆粒細(xì)胞中StAR和PKA蛋白的表達(dá)量顯著減少(P0.05)。綜上所述,orexin A能夠通過與其受體相結(jié)合,通過cAMP-PKA信號通路促進(jìn)綿羊卵巢黃體化顆粒細(xì)胞分泌孕酮。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S826
【圖文】：

圖 1 綿羊卵巢顆粒細(xì)胞Figure 1 Ovian granulosa cells注：A:原代綿羊卵巢顆粒細(xì)胞 B:F1 代綿羊卵巢顆粒細(xì)胞C: F2 代綿羊卵巢顆粒細(xì)胞 D: F3 代綿羊卵巢顆粒細(xì)胞顆粒細(xì)胞鑒定結(jié)果形態(tài)完整，邊緣清晰（見圖 2-A）。HE 染色后，鏡下可見細(xì)，分布均一，多呈梭形或不規(guī)則星形。胞漿呈淡紅色，細(xì)胞形（見圖 2-B）。 的熒光化學(xué)染色是鑒定顆粒細(xì)胞簡便快速的方法，F(xiàn)SHR 陽呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。鏡下可見與對照組相比 此表明體外分離培養(yǎng)的綿羊卵巢顆粒細(xì)胞純度已經(jīng)達(dá)到9D）。

圖 2 FSHR 在體外培養(yǎng)的綿羊卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)Fig 2 Sheep ovarian granulosa cells expressing FSHR in vitro注：A 為原代培養(yǎng) 24h 顆粒細(xì)胞 B 為 HE 染色卵巢顆粒細(xì)胞C1 為實(shí)驗(yàn)組 FSHR 綠色熒光 C2 為實(shí)驗(yàn)組核染 C 為 C1 和 C2 共染D1 為對照組綠色熒光 D2 為對照組核染 D 為 D1 和 D2 共染周期同步化處理及檢測結(jié)果培養(yǎng)綿羊卵巢顆粒細(xì)胞，傳至第三代，分別經(jīng)過血清饑餓處理 12h，用流式細(xì)胞儀分析對照組和兩個(gè)處理組細(xì)胞的周期相，然后研究卵巢化處理后細(xì)胞時(shí)相的改變。結(jié)果顯示，空白對照組，血清饑餓處理，和理組 G0+G1 期卵巢顆粒細(xì)胞的百分率分別為 65.2%，79.3%和 88.1%餓處理和 TdR 雙阻斷法均能將卵巢顆粒細(xì)胞很好的同步于 G0 期和 G斷法的同步化效率更高，有利于使后續(xù)黃體化處理試驗(yàn)保持一致性。

圖3 細(xì)胞周期檢測結(jié)果Fig 3 The results of ovarian granulosa cells4.4 卵巢顆粒細(xì)胞黃體化結(jié)果從表 8 及圖 4 分析可知，用 FSH、LH、E2 刺激 24 h 后，F(xiàn)LE 組與 no FLE 組相比，孕酮表達(dá)量顯著升高（P＜0.01），表明此卵巢黃體化顆粒細(xì)胞已被黃體化。表8 黃體化處理后孕酮分泌量結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 8 The of secretion progesterone after luteal treatment時(shí)間對照組 處理組NO FLE FLE0 h 2.8a±0.7 9.1b±0.224 h 4.2A±2.0 24.3B±0.4注：右上角標(biāo)有不同小寫字母的數(shù)據(jù)之間差異顯著（P<0.05），標(biāo)有不同大寫字母的數(shù)據(jù)之間差異極顯著（P<0.01）下同。No FLE：顆粒細(xì)胞 FLE：黃體化顆粒細(xì)胞空白對照 血清饑餓處理組

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本文編號：2779328