【摘要】：N6-甲基腺苷(m6A)修飾在真核生物mRNA中最普遍的內(nèi)部修飾,參與生命體的個(gè)體的成長(zhǎng)、細(xì)胞分化、疾病調(diào)控等多種生物學(xué)過(guò)程,是當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。生殖細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程,精子和卵母細(xì)胞的有機(jī)結(jié)合能夠發(fā)育形成一個(gè)復(fù)雜的有機(jī)體。在機(jī)體內(nèi)細(xì)胞分化發(fā)育的過(guò)程中,生殖器官有序產(chǎn)生精子和卵母細(xì)胞,但是目前關(guān)于睪丸和卵巢中精子和卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的m6A表觀(guān)修飾的相關(guān)研究較少,為了優(yōu)化精子和卵母細(xì)胞的體外發(fā)育環(huán)境,我們對(duì)精子和卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的m6A表觀(guān)修飾進(jìn)行了檢測(cè)分析,分別取12.5d胎兒生殖嵴、新生一周(7d)、雌性小鼠成年期(49d)卵巢中的卵泡期和黃體期,以及12.5d胎兒生殖嵴、新生一周(7d)和成年期雄性小鼠睪丸(49d)作為試驗(yàn)材料,通過(guò)HE組織染色、定量RT-PCR、免疫熒光染色和現(xiàn)代新型液質(zhì)聯(lián)用液相色譜等檢測(cè)手段相結(jié)合的方式進(jìn)行分析在不同時(shí)期的小鼠睪丸和卵巢組織的RNA的m6A的表觀(guān)修飾程度,并且通過(guò)檢測(cè)修飾酶在不同時(shí)期表達(dá)量的變化,揭示了精子和卵母細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育關(guān)鍵階段睪丸和卵巢組織中m6A表觀(guān)遺傳修飾程度的基本特征和規(guī)律,該研究對(duì)于哺乳動(dòng)物的生殖器官和生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控具有著重要的理論意義。試驗(yàn)包括以下四個(gè)部分:試驗(yàn)一:通過(guò)HE染色上述小鼠睪丸和卵巢組織不同時(shí)期進(jìn)行組織學(xué)觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)各個(gè)時(shí)期組織結(jié)構(gòu)確有差異。試驗(yàn)二:通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)對(duì)m6A在睪丸和卵巢細(xì)胞上定位,發(fā)現(xiàn)m6A信號(hào)定位于精子和卵母細(xì)胞以及絕大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,并且可以明顯觀(guān)察到m6A信號(hào)在不同時(shí)期的強(qiáng)弱。試驗(yàn)三:通過(guò)半定量的點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)和定量的高靈敏度的液相色譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè),點(diǎn)雜交的半定量結(jié)果顯示12.5dpc、新生一周、卵泡期和黃體期的雌性小鼠卵巢中m6A信號(hào)在黃體期最強(qiáng)。而在12.5dpc、新生一周、成年期雄性睪丸中m6A信號(hào)在成年期最強(qiáng)。另外通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定12.5dpc、新生一周、卵泡期和黃體期小鼠卵巢中m6A/A的含量同樣在黃體期達(dá)到最大,且相比12.5dpc期上升了4倍。而在12.5dpc、新生一周、成年期小鼠睪丸中m6A/A的含量同樣在成年期達(dá)到最大,且相比12.5dpc期上升了3倍。試驗(yàn)四:通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了m6A的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì),而去甲基轉(zhuǎn)移酶相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。結(jié)論:發(fā)現(xiàn)在小鼠睪丸和卵巢發(fā)育中,m6A的含量是一個(gè)遞增的趨勢(shì),生成m6A信號(hào)的甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平與m6A含量變化一致,而去除m6A信號(hào)的去甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平的變化與m6A含量變化相反。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S814
【圖文】：

及精子發(fā)生及早期胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)理[2]。迄學(xué)修飾結(jié)構(gòu)在真核生物 RNA 中被發(fā)現(xiàn)，其負(fù)責(zé)每種修飾的酶和這些酶所修飾的 RNA知的。而其中的 N6-甲基腺苷（m6A）修飾中最普遍的內(nèi)部修飾[3]。例如：酵母、擬南修飾，甚至在病毒的 RNA 中也存有 m6A 的 70 年代就被發(fā)現(xiàn)并被提出，然而，由于缺種類(lèi)的 RNA 壽命短的限制（平均哺乳動(dòng)物 修飾曾一度被認(rèn)為是靜態(tài)的，相對(duì)穩(wěn)定的礙了這種化學(xué)修飾的生物學(xué)作用研究[1, 5]。但化學(xué)修飾可以是動(dòng)態(tài)的并參與不同生理過(guò)程究發(fā)現(xiàn)了兩種哺乳動(dòng)物 RNA 去甲基化酶：源家族蛋白 alkbh5 被找到后，m6A 在 RNA浮現(xiàn)，同時(shí) m6A 在信使 RNA（mRNA）中也6A 修飾的生理意義僅在近年來(lái)才得到認(rèn)可[

廣泛的和動(dòng)態(tài)的 mRNA 甲基化（如圖2 所示）。結(jié)合 2012 年的檢測(cè)兩項(xiàng)研究和最近出版的其他研究組的結(jié)果顯示了一個(gè)驚人的發(fā)現(xiàn)，即 m6A 殘基在 5’(UTRs)非翻譯區(qū)，終止密碼子周?chē)约芭c哺乳動(dòng)物 mRNA 中終止密碼子相鄰的 3’(UTRs)翻譯區(qū)富集，其次，m6A 標(biāo)記在轉(zhuǎn)錄組中的不均勻分布，它們優(yōu)先富集于接近終止密碼子的共有序列子集，3'UTR 和長(zhǎng)內(nèi)部外顯子內(nèi)[18]。

70]。但其更加詳盡的作用機(jī)制還有待研究。（如表 1，圖 3）表 1. m6A 的修飾酶、去修飾酶、識(shí)別因子Table 1. Methyltransferases, demethyltransferases, recognition factors for m6A類(lèi)別 基因 主要功能修飾酶 mettl3,mettl14,WTAP都是甲基轉(zhuǎn)移酶，mettl3 和 mettl14,在體內(nèi)和體外催化RNA發(fā)生m6A甲基化修飾，而WTAP則是mettl3和 mettl14 復(fù)合物的組成部分，他們均含有共有基序去修飾酶fto,alkbh5 以及其他homologles 都是去甲基轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo) m6A 的去甲基化修飾識(shí)別因子YTH 蛋白家族（Ythdc1-2 和Ythdf1-3）以及其他homologles都是 RNA 甲基化修飾的識(shí)別因子，參與下游調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程，這些識(shí)別因子均含有 YTH蛋白結(jié)構(gòu)域

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 羅蘭;張彥;楊芳;楊榆玲;;小鼠睪丸發(fā)育全過(guò)程的組織學(xué)觀(guān)察[J];實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);2010年03期

2 徐富翠,吳紹華,鄭福蓉,劉廣益;小鼠生后不同發(fā)育階段睪丸生殖細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)研究[J];瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年04期

3 徐邦生,蔡云平;小鼠睪丸、附睪發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)學(xué)研究[J];交通醫(yī)學(xué);2001年01期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 羅陽(yáng);小鼠卵巢不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D];中南大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2778428