【摘要】：N6-甲基腺苷(m6A)修飾在真核生物mRNA中最普遍的內部修飾,參與生命體的個體的成長、細胞分化、疾病調控等多種生物學過程,是當前生命科學研究的熱點。生殖細胞的發(fā)生發(fā)育是一個極其復雜的過程,精子和卵母細胞的有機結合能夠發(fā)育形成一個復雜的有機體。在機體內細胞分化發(fā)育的過程中,生殖器官有序產生精子和卵母細胞,但是目前關于睪丸和卵巢中精子和卵母細胞發(fā)育過程中的m6A表觀修飾的相關研究較少,為了優(yōu)化精子和卵母細胞的體外發(fā)育環(huán)境,我們對精子和卵母細胞發(fā)育過程中關鍵環(huán)節(jié)的m6A表觀修飾進行了檢測分析,分別取12.5d胎兒生殖嵴、新生一周(7d)、雌性小鼠成年期(49d)卵巢中的卵泡期和黃體期,以及12.5d胎兒生殖嵴、新生一周(7d)和成年期雄性小鼠睪丸(49d)作為試驗材料,通過HE組織染色、定量RT-PCR、免疫熒光染色和現代新型液質聯用液相色譜等檢測手段相結合的方式進行分析在不同時期的小鼠睪丸和卵巢組織的RNA的m6A的表觀修飾程度,并且通過檢測修飾酶在不同時期表達量的變化,揭示了精子和卵母細胞體內發(fā)育關鍵階段睪丸和卵巢組織中m6A表觀遺傳修飾程度的基本特征和規(guī)律,該研究對于哺乳動物的生殖器官和生殖細胞的生長發(fā)育調控具有著重要的理論意義。試驗包括以下四個部分:試驗一:通過HE染色上述小鼠睪丸和卵巢組織不同時期進行組織學觀察,發(fā)現各個時期組織結構確有差異。試驗二:通過免疫熒光染色技術對m6A在睪丸和卵巢細胞上定位,發(fā)現m6A信號定位于精子和卵母細胞以及絕大多數細胞的細胞質中,并且可以明顯觀察到m6A信號在不同時期的強弱。試驗三:通過半定量的點雜交實驗和定量的高靈敏度的液相色譜實驗進行檢測,點雜交的半定量結果顯示12.5dpc、新生一周、卵泡期和黃體期的雌性小鼠卵巢中m6A信號在黃體期最強。而在12.5dpc、新生一周、成年期雄性睪丸中m6A信號在成年期最強。另外通過質譜測定12.5dpc、新生一周、卵泡期和黃體期小鼠卵巢中m6A/A的含量同樣在黃體期達到最大,且相比12.5dpc期上升了4倍。而在12.5dpc、新生一周、成年期小鼠睪丸中m6A/A的含量同樣在成年期達到最大,且相比12.5dpc期上升了3倍。試驗四:通過RT-PCR檢測了m6A的甲基轉移酶和去甲基轉移酶的表達量,發(fā)現甲基轉移酶相對表達量呈上升趨勢,而去甲基轉移酶相對表達量呈下降趨勢。結論:發(fā)現在小鼠睪丸和卵巢發(fā)育中,m6A的含量是一個遞增的趨勢,生成m6A信號的甲基轉移酶的表達水平與m6A含量變化一致,而去除m6A信號的去甲基轉移酶的表達水平的變化與m6A含量變化相反。
【學位授予單位】：安徽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S814
【圖文】：

及精子發(fā)生及早期胚胎發(fā)育調控機理[2]。迄學修飾結構在真核生物 RNA 中被發(fā)現，其負責每種修飾的酶和這些酶所修飾的 RNA知的。而其中的 N6-甲基腺苷（m6A）修飾中最普遍的內部修飾[3]。例如：酵母、擬南修飾，甚至在病毒的 RNA 中也存有 m6A 的 70 年代就被發(fā)現并被提出，然而，由于缺種類的 RNA 壽命短的限制（平均哺乳動物 修飾曾一度被認為是靜態(tài)的，相對穩(wěn)定的礙了這種化學修飾的生物學作用研究[1, 5]。但化學修飾可以是動態(tài)的并參與不同生理過程究發(fā)現了兩種哺乳動物 RNA 去甲基化酶：源家族蛋白 alkbh5 被找到后，m6A 在 RNA浮現，同時 m6A 在信使 RNA（mRNA）中也6A 修飾的生理意義僅在近年來才得到認可[

廣泛的和動態(tài)的 mRNA 甲基化（如圖2 所示）。結合 2012 年的檢測兩項研究和最近出版的其他研究組的結果顯示了一個驚人的發(fā)現，即 m6A 殘基在 5’(UTRs)非翻譯區(qū)，終止密碼子周圍以及與哺乳動物 mRNA 中終止密碼子相鄰的 3’(UTRs)翻譯區(qū)富集，其次，m6A 標記在轉錄組中的不均勻分布，它們優(yōu)先富集于接近終止密碼子的共有序列子集，3'UTR 和長內部外顯子內[18]。

70]。但其更加詳盡的作用機制還有待研究。（如表 1，圖 3）表 1. m6A 的修飾酶、去修飾酶、識別因子Table 1. Methyltransferases, demethyltransferases, recognition factors for m6A類別 基因 主要功能修飾酶 mettl3,mettl14,WTAP都是甲基轉移酶，mettl3 和 mettl14,在體內和體外催化RNA發(fā)生m6A甲基化修飾，而WTAP則是mettl3和 mettl14 復合物的組成部分，他們均含有共有基序去修飾酶fto,alkbh5 以及其他homologles 都是去甲基轉移酶，介導 m6A 的去甲基化修飾識別因子YTH 蛋白家族（Ythdc1-2 和Ythdf1-3）以及其他homologles都是 RNA 甲基化修飾的識別因子，參與下游調控以及轉錄、翻譯等過程，這些識別因子均含有 YTH蛋白結構域

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 羅蘭;張彥;楊芳;楊榆玲;;小鼠睪丸發(fā)育全過程的組織學觀察[J];實驗動物科學;2010年03期

2 徐富翠,吳紹華,鄭福蓉,劉廣益;小鼠生后不同發(fā)育階段睪丸生殖細胞的超微結構研究[J];瀘州醫(yī)學院學報;2005年04期

3 徐邦生,蔡云平;小鼠睪丸、附睪發(fā)育過程中的形態(tài)學研究[J];交通醫(yī)學;2001年01期

相關碩士學位論文 前1條

1 羅陽;小鼠卵巢不同發(fā)育階段的轉錄組學研究[D];中南大學;2012年

本文編號：2778428