【摘要】：剛地弓形蟲是人獸共患寄生蟲病,可以感染幾乎所有的溫血動物,通過其分泌蛋白改變宿主細(xì)胞的信號通路狀態(tài)、調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)量,進(jìn)而影響宿主的生命活動進(jìn)程。根據(jù)弓形蟲感染小鼠的毒力可以分為:I型、II型和III型。近些年來,隨著經(jīng)濟的增長,人們生活水平的不斷提高,對豬肉的需求大幅上漲,然而豬弓形蟲病不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失,同時也造成了我國居民弓形蟲感染率的上升。由于目前對弓形蟲病防控的基礎(chǔ)研究不足,尤其是對弓形蟲與宿主之間相互作用的分子機制尚不清楚。因此,國內(nèi)外許多科研工作者建立動物模型,用于研究對弓形蟲與宿主之間相互作用的分子機制。本研究利用RNA-Seq高通量測序研究不同基因型弓形蟲對豬巨噬細(xì)胞感染后的轉(zhuǎn)錄組變化,鑒定出弓形蟲感染細(xì)胞后的差異表達(dá)的基因及免疫途徑,發(fā)現(xiàn)不同基因型弓形蟲在調(diào)控型I干擾素和NF-κB信號通路的差異,通過弓形蟲感染BALB/c小鼠,利用Real-time PCR檢測小鼠脾臟中細(xì)胞因子的變化,同時利用Western Blot研究GRA15調(diào)控NF-κB信號通路的分子機制,將質(zhì)粒GRA15電轉(zhuǎn)到RAW264.7細(xì)胞,研究其對免疫因子的影響。(1)不同基因型弓形蟲的速殖子感染3D4/21細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組分析將RH、HB1和ME49弓形蟲速殖子感染3D4/21細(xì)胞,利用RNA-Seq高通量測序檢測6h、12h和24h時間點轉(zhuǎn)錄組的變化,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因隨著感染時間的延長而增加,Ⅱ型蟲株誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因明顯高于Ⅰ型蟲株,進(jìn)行GO富集和KEGG分析,三種弓形蟲速殖子在涉及巨噬細(xì)胞的免疫或疾病相關(guān)途徑存在差異。(2)不同基因型弓形蟲對小鼠脾臟的免疫因子的影響通過腹腔接種弓形蟲Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠,根據(jù)不同基因型弓形蟲的毒力,設(shè)置不同的時間間隔來定時收取脾臟組織。利用Real-time PCR技術(shù)檢測小鼠先天性免疫細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中,IFN-γ和IL-10的表達(dá)變化十分明顯,且均在感染后期有著很高的表達(dá)量。而相對地,PD-1在各基因型弓形蟲感染中所誘導(dǎo)的表達(dá)量較低,且隨時間變化不太明顯。(3)GRA15激活NF-κB信號通路的分子機制將GRA15質(zhì)粒脂質(zhì)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞,利用Western blot檢測細(xì)胞中IκB和p-IκB的表達(dá),發(fā)現(xiàn)p-IκB的表達(dá)水平顯著增加,當(dāng)使用IκB激酶抑制劑MG-132后p-IκB表達(dá)水平明顯減少。結(jié)果說明GRA15有可能是通過降解IκB蛋白來激活NF-κB信號通路。(4)GRA15對RAW 264.7細(xì)胞因子的影響使用電穿孔法將GRA15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中,分別收集12h和24h的細(xì)胞,通過Real-time PCR檢測細(xì)胞因子的表達(dá)水平。實驗結(jié)果表明,GRA15(-4)可以引起細(xì)胞IFN-β表達(dá)量的顯著上升;GRA15(I)和GRA15(II)則可以激活并誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IFN-γ;而GRA15(I)、GRA15(II)以及GRA15(-4)對IL-12、TNF-α、i NOS和PD1均無明顯影響。本研究首次對豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/21)感染不同基因型弓形蟲后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究和分析,描述了細(xì)胞感染弓形蟲后差異基因的表達(dá)變化。同時,在不同時間點鑒定的功能性差異表達(dá)基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御機制,促進(jìn)對弓形蟲感染的預(yù)防和控制,了解這些途徑提供的信息可能對開發(fā)合理設(shè)計的弓形蟲治療劑和疫苗至關(guān)重要。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位論文形蟲的傳播速度比給小鼠喂卵囊的速度快(Dubey 1997)。接種 1 小時后，在小鼠腸上皮細(xì)胞中檢測到緩殖子，并在 2 小時內(nèi)分化為速殖子(Dubey 1997)。48 小時后，能在淋巴結(jié)中檢測到速殖子。一旦速殖子感染遷移細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，它們可以迅速分散到整個宿主中(Ueno et al 2014)。最終，來自免疫系統(tǒng)的壓力誘導(dǎo)速殖子轉(zhuǎn)化為慢性感染相關(guān)的無性生殖階段。含有緩殖子的包囊可以在橫紋肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中存活數(shù)十年(Dubey et al 1998)。當(dāng)未感染的貓科動物吞食慢性感染的中間宿主時，弓形蟲進(jìn)入下一個生殖循環(huán)。

3.1.2 蟲株、菌株和細(xì)胞E.coli 菌株 DH5α 由本實驗保存；剛地弓形蟲 RH、Me49 和 HB1 株速殖子由本實驗室液氮保存；人腎上皮細(xì)胞 HEK293T 細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 和人成纖維細(xì)胞HFF 由本實驗室液氮保存；Ⅱ型弓形蟲致密顆粒蛋白 15 質(zhì)粒 pCMV-GRA15(Ⅱ)、Ⅰ型弓形蟲致密顆粒蛋白 15 質(zhì)粒 pCMV-GRA15(Ⅰ)、Ⅰ型弓形蟲致密顆粒蛋白 15 截短質(zhì)粒pCMV-GRA15(-4)、NF-κB 啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒 pNF-κB 和表達(dá)海腎熒光素酶的內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-TK 均由本實驗室保存。3.1.3 載體和質(zhì)粒

豬巨噬細(xì)胞感染不同基因型弓形蟲后的轉(zhuǎn)錄組研究4. 結(jié)果與分析4.1 樣品 RNA 質(zhì)量檢測的結(jié)果所有的 RNA 樣品經(jīng)過 Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測，結(jié)果顯示所有的 RNA樣品檢測結(jié)果為合格，其中 RNA 樣品的濃度均在 99 ng/ul 以上, RIN 值均在 9.0以上，28S 與 18S 的比值均大于 2.0，所有的 RNA 樣品濃度和總量能夠滿足試驗要求，為后續(xù)試驗的準(zhǔn)確性提供保證。

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本文編號：2778343