【摘要】：剛地弓形蟲(chóng)是人獸共患寄生蟲(chóng)病,可以感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游?通過(guò)其分泌蛋白改變宿主細(xì)胞的信號(hào)通路狀態(tài)、調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)量,進(jìn)而影響宿主的生命活動(dòng)進(jìn)程。根據(jù)弓形蟲(chóng)感染小鼠的毒力可以分為:I型、II型和III型。近些年來(lái),隨著經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng),人們生活水平的不斷提高,對(duì)豬肉的需求大幅上漲,然而豬弓形蟲(chóng)病不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也造成了我國(guó)居民弓形蟲(chóng)感染率的上升。由于目前對(duì)弓形蟲(chóng)病防控的基礎(chǔ)研究不足,尤其是對(duì)弓形蟲(chóng)與宿主之間相互作用的分子機(jī)制尚不清楚。因此,國(guó)內(nèi)外許多科研工作者建立動(dòng)物模型,用于研究對(duì)弓形蟲(chóng)與宿主之間相互作用的分子機(jī)制。本研究利用RNA-Seq高通量測(cè)序研究不同基因型弓形蟲(chóng)對(duì)豬巨噬細(xì)胞感染后的轉(zhuǎn)錄組變化,鑒定出弓形蟲(chóng)感染細(xì)胞后的差異表達(dá)的基因及免疫途徑,發(fā)現(xiàn)不同基因型弓形蟲(chóng)在調(diào)控型I干擾素和NF-κB信號(hào)通路的差異,通過(guò)弓形蟲(chóng)感染BALB/c小鼠,利用Real-time PCR檢測(cè)小鼠脾臟中細(xì)胞因子的變化,同時(shí)利用Western Blot研究GRA15調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制,將質(zhì)粒GRA15電轉(zhuǎn)到RAW264.7細(xì)胞,研究其對(duì)免疫因子的影響。(1)不同基因型弓形蟲(chóng)的速殖子感染3D4/21細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組分析將RH、HB1和ME49弓形蟲(chóng)速殖子感染3D4/21細(xì)胞,利用RNA-Seq高通量測(cè)序檢測(cè)6h、12h和24h時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組的變化,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,Ⅱ型蟲(chóng)株誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因明顯高于Ⅰ型蟲(chóng)株,進(jìn)行GO富集和KEGG分析,三種弓形蟲(chóng)速殖子在涉及巨噬細(xì)胞的免疫或疾病相關(guān)途徑存在差異。(2)不同基因型弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠脾臟的免疫因子的影響通過(guò)腹腔接種弓形蟲(chóng)Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠,根據(jù)不同基因型弓形蟲(chóng)的毒力,設(shè)置不同的時(shí)間間隔來(lái)定時(shí)收取脾臟組織。利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠先天性免疫細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中,IFN-γ和IL-10的表達(dá)變化十分明顯,且均在感染后期有著很高的表達(dá)量。而相對(duì)地,PD-1在各基因型弓形蟲(chóng)感染中所誘導(dǎo)的表達(dá)量較低,且隨時(shí)間變化不太明顯。(3)GRA15激活NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制將GRA15質(zhì)粒脂質(zhì)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞,利用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中IκB和p-IκB的表達(dá),發(fā)現(xiàn)p-IκB的表達(dá)水平顯著增加,當(dāng)使用IκB激酶抑制劑MG-132后p-IκB表達(dá)水平明顯減少。結(jié)果說(shuō)明GRA15有可能是通過(guò)降解IκB蛋白來(lái)激活NF-κB信號(hào)通路。(4)GRA15對(duì)RAW 264.7細(xì)胞因子的影響使用電穿孔法將GRA15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中,分別收集12h和24h的細(xì)胞,通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GRA15(-4)可以引起細(xì)胞IFN-β表達(dá)量的顯著上升;GRA15(I)和GRA15(II)則可以激活并誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IFN-γ;而GRA15(I)、GRA15(II)以及GRA15(-4)對(duì)IL-12、TNF-α、i NOS和PD1均無(wú)明顯影響。本研究首次對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/21)感染不同基因型弓形蟲(chóng)后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究和分析,描述了細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)后差異基因的表達(dá)變化。同時(shí),在不同時(shí)間點(diǎn)鑒定的功能性差異表達(dá)基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御機(jī)制,促進(jìn)對(duì)弓形蟲(chóng)感染的預(yù)防和控制,了解這些途徑提供的信息可能對(duì)開(kāi)發(fā)合理設(shè)計(jì)的弓形蟲(chóng)治療劑和疫苗至關(guān)重要。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S858.28
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位論文形蟲(chóng)的傳播速度比給小鼠喂卵囊的速度快(Dubey 1997)。接種 1 小時(shí)后，在小鼠腸上皮細(xì)胞中檢測(cè)到緩殖子，并在 2 小時(shí)內(nèi)分化為速殖子(Dubey 1997)。48 小時(shí)后，能在淋巴結(jié)中檢測(cè)到速殖子。一旦速殖子感染遷移細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，它們可以迅速分散到整個(gè)宿主中(Ueno et al 2014)。最終，來(lái)自免疫系統(tǒng)的壓力誘導(dǎo)速殖子轉(zhuǎn)化為慢性感染相關(guān)的無(wú)性生殖階段。含有緩殖子的包囊可以在橫紋肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中存活數(shù)十年(Dubey et al 1998)。當(dāng)未感染的貓科動(dòng)物吞食慢性感染的中間宿主時(shí)，弓形蟲(chóng)進(jìn)入下一個(gè)生殖循環(huán)。

3.1.2 蟲(chóng)株、菌株和細(xì)胞E.coli 菌株 DH5α 由本實(shí)驗(yàn)保存；剛地弓形蟲(chóng) RH、Me49 和 HB1 株速殖子由本實(shí)驗(yàn)室液氮保存；人腎上皮細(xì)胞 HEK293T 細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 和人成纖維細(xì)胞HFF 由本實(shí)驗(yàn)室液氮保存；Ⅱ型弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白 15 質(zhì)粒 pCMV-GRA15(Ⅱ)、Ⅰ型弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白 15 質(zhì)粒 pCMV-GRA15(Ⅰ)、Ⅰ型弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白 15 截短質(zhì)粒pCMV-GRA15(-4)、NF-κB 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒 pNF-κB 和表達(dá)海腎熒光素酶的內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-TK 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。3.1.3 載體和質(zhì)粒

豬巨噬細(xì)胞感染不同基因型弓形蟲(chóng)后的轉(zhuǎn)錄組研究4. 結(jié)果與分析4.1 樣品 RNA 質(zhì)量檢測(cè)的結(jié)果所有的 RNA 樣品經(jīng)過(guò) Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測(cè)，結(jié)果顯示所有的 RNA樣品檢測(cè)結(jié)果為合格，其中 RNA 樣品的濃度均在 99 ng/ul 以上, RIN 值均在 9.0以上，28S 與 18S 的比值均大于 2.0，所有的 RNA 樣品濃度和總量能夠滿足試驗(yàn)要求，為后續(xù)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性提供保證。

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本文編號(hào)：2778343