【摘要】：細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是機(jī)體為保障自身穩(wěn)態(tài)平衡通過調(diào)控基因表達(dá)使細(xì)胞發(fā)生自主有次序的死亡過程。病毒感染引起的細(xì)胞凋亡是宿主為抵御病原體復(fù)制和擴(kuò)散的防御機(jī)制。如果細(xì)胞凋亡發(fā)生在子代病毒組裝過程中,則宿主會利用免疫監(jiān)視和防御功能及時將子代病毒吞噬并排除體外。因此很多病毒會通過某種機(jī)制來抑制宿主死亡,以期保證病毒能在宿主內(nèi)穩(wěn)定存活。相反,當(dāng)病毒完成裝配后,又會利用宿主的促凋亡機(jī)制進(jìn)而擴(kuò)散其子代病毒。塞內(nèi)卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是目前塞內(nèi)卡病毒屬唯一成員,它是無囊膜、單股正鏈小RNA病毒。2002年SVA初次在培養(yǎng)人胎兒視網(wǎng)膜細(xì)胞的培養(yǎng)基內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。豬作為SVA的易感動物,感染后表現(xiàn)為,吻突或口腔粘膜處會發(fā)生完整或破裂的小泡,并且蹄部出現(xiàn)水泡破裂而致使跛行。同時,新生仔豬感染SVA后會發(fā)生急性死亡。SVA作為小核糖核酸病毒科的一類新病原,感染宿主后對宿主細(xì)胞凋亡產(chǎn)生調(diào)控作用不清楚。通過HE染色和石蠟切片熒光TUNEL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SVA能夠引起宿主組織產(chǎn)生明顯病理變化,并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。為探究SVA對宿主細(xì)胞凋亡的作用,首先通過顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)SVA感染能引起PK-15和HEK293T細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。通過qPCR實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)SVA能夠在293T細(xì)胞中復(fù)制,并且與對照相比SVA能顯著性的誘導(dǎo)293T細(xì)胞凋亡。其次通過Western Blotting及流式細(xì)胞術(shù)篩選SVA各蛋白表明,SVA結(jié)構(gòu)蛋白VP1具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能且呈劑量依賴性。最后,為進(jìn)一步探索SVA-VP1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,通過Annexin-V-FITC/PI染色熒光觀察發(fā)現(xiàn),VP1能使細(xì)胞發(fā)生早期和晚期細(xì)胞凋亡。免疫共沉淀、間接免疫熒光以及線粒體分離實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SVA-VP1亞細(xì)胞定位于線粒體,并且與促凋亡蛋白BAD在線粒體上發(fā)生相互作用。通過瞬時轉(zhuǎn)染BAD表明,BAD能促進(jìn)VP1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。然而采用siRNA干擾技術(shù)敲低BAD后,VP1誘導(dǎo)凋亡的功能顯著性降低。Western Blotting以及qPCR試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),VP1能夠促進(jìn)BAD及其下游蛋白BAX的表達(dá)及Caspase3的剪切活化,但對上游蛋白AKT、JNK及其的磷酸化無影響。而將BAD敲低后,VP1對BAX和Caspase3蛋白水平和mRNA水平的促進(jìn)作用消失了。通過qPCR檢測還發(fā)現(xiàn),在SVA感染細(xì)胞后期,BAD能夠促進(jìn)SVA的復(fù)制。以上實(shí)驗(yàn)表明,VP1依賴于BAD激活線粒體凋亡通路,且BAD促進(jìn)SVA復(fù)制。本研究表明,細(xì)胞在感染SVA后,通過其結(jié)構(gòu)蛋白VP1與促凋亡蛋白BAD在線粒體上特異性互作,并依賴于BAD促進(jìn)促凋亡蛋白BAX和Caspase3的表達(dá)及活化,最終導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。本結(jié)果有助于揭示SVA利用宿主蛋白影響宿主細(xì)胞凋亡及自身復(fù)制的分子機(jī)制,為更深入的揭示SVA的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

圖 2.2 SVA 使組織細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡（10×）Fig 2.2 SVA caused tissues apoptotic（10×）.2 SVA 感染使細(xì)胞產(chǎn)生病變

SVA在293T細(xì)胞中復(fù)制Fig2.4SVAcanreplicatein293Tcell

圖 2.3 感染 SVA 后細(xì)胞發(fā)生明顯病變(200×)ig 2.3 Significant cytopathic effect in cells after infection with SVA (200注：NC 為空白細(xì)胞，下同Note: NC is the blank cells, the same below3T 細(xì)胞中復(fù)制并引起細(xì)胞凋亡

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本文編號：2778279