【摘要】：副結(jié)核(Paratuberculosis),也稱為約翰氏病(Johne'sdisease),由鳥分枝桿菌亞種的副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumavium subspeciesparatuberculosis,MAP)引起,是一種重要且極為普遍的反芻動物疾病,造成嚴重的經(jīng)濟損失。但是由于該細菌分離純化難度較大,至今還缺少中國MAP分離株及其基因組信息。巨噬細胞被認為是MAP感染早期的主要宿主細胞,巨噬細胞的凋亡直接影響著MAP在細胞內(nèi)的存活情況。但是關(guān)于MAP感染巨噬細胞后是否會引起細胞凋亡尚不明確。牛結(jié)核病(bTB)是一種慢性傳染性細菌疾病,主要在野生動物、家畜以及人類中發(fā)現(xiàn)。它是由牛分枝桿菌(M.bovis)引起,主要通過氣溶膠感染。全世界約有10%的人結(jié)核病病例是由牛分枝桿菌引起的。M.bvis與MAP常常可以同時感染同一個牛場,但是關(guān)于這兩種病原體混合感染的研究卻相對較少。因此,研究MAP與M.bois混合感染的免疫機制可以為牛副結(jié)核病及結(jié)核病的防治提供科學(xué)依據(jù)。1.本研究首要任務(wù)是分離中國的MAP菌株。通過ELISA檢測某省19個奶牛場的MAP抗體的陽性率,篩選陽性率高的奶牛場,追蹤MAP抗體陽性的淘汰奶牛,進行組織病理學(xué)觀察,用HPC處理直腸糞便進行MAP分離,通過抗染色進行純度檢測,通過PCR-REA的方法對MAP菌株進行分型,同時用高通量測序技術(shù)對MAP分離株進行全基因組測序,用SOAPdenovo對短片段進行組裝,通過BWA對短片段進行匹配,用SAM工具篩選SNP和indel。使用MEGA制作進化樹。本研究成功地從中國奶牛場中分離出兩株MAP菌株,并確定了這兩株菌株均為MAP-C,并且證明了中國MAP分離株2015WD-1和2015WD-2與國際參考株MAPK-10關(guān)系最密切。2.用不同MOI值(MOI=1,5,10)的MAP2015WD-1菌株感染巨噬細胞J774A.1,在感染后12h檢測J774A.1的凋亡情況。結(jié)果表明,僅在MAP的MOI為10時,可以引起巨噬細胞的凋亡。因此,我們用MOI=10的感染復(fù)數(shù)感染J774A.1,使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激動劑Tm預(yù)處理巨噬細胞,通過Western bloting、RT-PCR流式細胞術(shù)以及透射電鏡等技術(shù)探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了 MAP誘導(dǎo)的J774A.1的細胞凋亡。結(jié)果證明,MAP可以引起J774A.1的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并且在用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA預(yù)處理后,細胞凋亡減少,用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動劑Tm預(yù)處理后,細胞凋亡增多,因而從正反兩反面證明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了 MAP誘導(dǎo)的凋亡。我們進一步研究了巨噬細胞的極化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的關(guān)系。用LPS、IFN-γ處理將J774A.1誘導(dǎo)分化為Ml巨噬細胞,用IL-4處理誘導(dǎo)分化為M2巨噬細胞,用MAP分別感染Ml和M2(MOI=10),在不同的時間點檢測細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況。結(jié)果表明,M1比M2巨噬細胞更容易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)所介導(dǎo)的細胞凋亡。3.本研究構(gòu)建了 MAP與M.bovis混合感染的小鼠模型,通過觀察體重及死亡情況的變化以及組織病理學(xué)觀察來評估MAP對小鼠感染M bovis進程的影響;通過ProcartaPlex Multiplex Immunoassay 檢測小鼠在感染后 1,3 和 6 周血清中 TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-9,IL-10,IL-22,IL-13,IL-27,IL-23,IL-12P70,GM-CSF,IL-18和IL-17A的濃度變化;通過流式細胞術(shù)來探究脾臟及肺臟中CD4及CD8T細胞亞群的比例及脾臟中Th1/Th2反應(yīng)、記憶性T細胞表型及多功能性T細胞的比例;通過免疫組化方法探究小鼠單獨感染M.bovis與混合感染MAP之間肺臟中IFN-β的表達情況。結(jié)果表明提前感染MAP,可以抑制M.bovis感染小鼠的進程。對其產(chǎn)生影響的機制探究發(fā)現(xiàn),MAP+ M.bovis小鼠可以通過減少肺臟中IFN-β的產(chǎn)量、誘導(dǎo)CD4+T細胞的產(chǎn)生、增強Th1反應(yīng)以及增加脾臟中多功能性CD4+T細胞的數(shù)量來延長小鼠的存活時間或降低死亡率。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61
【圖文】：

ＡＦＬＰ進行再劃分。ＡＦＬＰ分析與以往的研究相比，其顯著特點是人類菌株表現(xiàn)出高逡逑度異質(zhì)性。類似的研究表明，很多人的菌株對判定牛與人之間ＭＡＰ傳播的可能性非逡逑常重要（圖１－１）。例如，八聚體為基礎(chǔ)的基因組掃描鑒定了在美國牛群中廣為傳播的逡逑大腸桿菌０１５７：邋Ｈ７的兩個譜系［６］。這個分析顯示，一些從牛和人類中獲得的類型并逡逑不是隨機分到譜系中的。這個表明，牛源的分離株對人沒有致病性。相反，雖然人的逡逑分離株數(shù)目有限，但通過ＡＦＬＰ分析ＭＡＰ菌株，似乎與這個趨勢不匹配［７］。如果牛逡逑的ＭＡＰ分離株不容易傳播給人類，生牛奶或摻假牛奶作為ＣＤ病人ＭＡＰ感染的傳逡逑染源將會很難維持（圖１－１）。逡逑ＭＡＰ邋Ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｃｏｗ逡逑嫩，＝ｔｅ邋１邐—逡逑－邐＾邐＾邋ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ逡逑Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邐ｐａｓｔａｙ邋ｒｉｚａｔｉｏｉｉ，邋ｊ逡逑：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邐ｓｏｒｒｍ邋ｂａｃｉｌｌｉ邋ｍｍａｉｎ逡逑ｓｔｒａｉｎｓ邋ＡＦＬＰ）邐（ａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ邋ｍｉｌｋ）逡逑４逡逑ｎｐ邐Ｈｏｍａｎ逡逑：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邐ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ逡逑ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邐＊逡逑ｓｔｒａｉｎｓ邋＜ｅ．ｇ．邋ＡＦＬＰ）逡逑Ｖ邐＃逡逑Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ／邋Ｏｕｉｔｙｒｅ邋Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ／ｗｉｌｄｌｌｆｅ逡逑Ｗｉ，ｌＳｒＰ邋１＾＝邋ＣｅＪ＾Ｔｕｌ＾ｓ）逡逑圖１－１ＭＡＰ傳染給人的潛在途徑（Ｃｈａｃｏｎ

和ＬＡＭＰ－３與次級內(nèi)體的聯(lián)合，反之，阻止ＭＡＰＫ－Ｐ３８信號引起吞噬體的酸化和次逡逑級內(nèi)體標記物的富集。這意味著ＭＡＰＫ－Ｐ３８在吞噬溶酶體的生物起源中起到一個負逡逑調(diào)節(jié)的作用［５２］。（圖１－２）逡逑，邐展：■：邋一逡逑圖１－２邋ＭＡＰ抑制吞嗤溶酶體的成熟（Ｒｙａｎ邋Ｊ邋Ａｒｓｅｎａｕｌｔ，２０１４）逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－２邋Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｈａｇｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ邋ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ邋ｂｙ邋ＭＡＰ逡逑１．２．３邋ＭＡＰ阻止巨噬細胞的應(yīng)答逡逑Ｌ２．３．１模式識別受體逡逑模式識別受體（ＰＲＲｓ）在誘導(dǎo)宿主保護性反應(yīng)中感知微生物感染中發(fā)揮作用。逡逑ＰＲＲｓ通過結(jié)合受體特異性的病原體相關(guān)分子模式（ＰＡＭＰｓ）而被激活。Ｔｏｌｌ樣受體逡逑（ＴＬＲｓ）代表了一種主要的ＰＲＲ亞類。除了由不同種ＴＬＲｓ產(chǎn)生的標準的免疫誘導(dǎo)逡逑和細胞因子應(yīng)答之外，其它的對分枝桿菌致病機理重要的細胞進程同樣是由ＴＬＲ介逡逑導(dǎo)，包括吞噬體的成熟。在ＴＬＲ系統(tǒng)中成熟的個體表現(xiàn)出對多種感染的易感性增強，逡逑包括分枝桿菌［５３］。而且，ＴＬＲ對自然ＭＡＰ感染應(yīng)答表達的動態(tài)水平提示著它在抵抗逡逑ＭＡＰ的機制中起作用［５４］。特定的ＴＬＲｓ的激活，如ＴＬＲ９，產(chǎn)生對抵抗ＭＡＰ至關(guān)重逡逑要的應(yīng)答，然而，其它ＴＬＲｓ的激活，如ＴＬＲ２，誘導(dǎo)抑制抵抗ＭＡＰ的免疫防御反應(yīng)。逡逑１．２．３．２邋ＴＬＲ９在巨噬細胞對ＭＡＰ產(chǎn)生免疫應(yīng)答的作用逡逑雖然許多哺乳動物的ＴＬＲｓ參與到了控制分枝桿菌的感染中

陷的小鼠中，存在過量的ＩＬ－１２ｐ４０，并且這種過量與樹突狀細胞向引流淋巴結(jié)的遷移逡逑增加和抗原特異性Ｔ細胞的誘導(dǎo)增加有關(guān)。這些小鼠也能比完整小鼠更好地控制Ｍｔｂ逡逑的生長［１（）６］（圖１－５）。其他研究表明，表達趨化因子受體ＣＣＲ２的炎性單核細胞是細逡逑菌從肺移動到引流淋巴結(jié)所必需的［９４］。也許在ＩＬ－１２ｐ４０和ＣＣＲ２的趨化因子配體逡逑ＣＣＬ２之間存在重要的平衡。在具有ＣＣＬ２啟動子多態(tài)性的人類中，應(yīng)答于Ｍｔｂ的逡逑ＣＣＬ２的產(chǎn)量增加，并伴有ＩＬ－１２ｐ４０反應(yīng)的減少［１（）７］。具有這種多態(tài)性的個體患結(jié)核逡逑病的發(fā)病率增加了

【參考文獻】

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本文編號：2777069