【摘要】：近年來(lái),禽類星狀病毒對(duì)家禽業(yè)的影響受到了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。其中雞星狀病毒(Chicken astrovirus,CAstV)可單獨(dú)引起雛雞腎炎、腹瀉性腸炎及發(fā)育緩慢等癥狀,是導(dǎo)致雛雞腹瀉、痛風(fēng)等疾病的重要病原體之一。目前我國(guó)雞星狀病毒病分子流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果還未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道,為了解CAstV在我國(guó)雞群中的流行情況,本研究開(kāi)展了我國(guó)部分地區(qū)雞星狀病毒病分子流行病學(xué)調(diào)查工作,建立了檢測(cè)雞星狀病毒的絕對(duì)熒光定量方法,同時(shí)還分離了一株雞星狀病毒,為進(jìn)一步研究雞星狀病毒生物學(xué)功能提供了技術(shù)手段和生物材料。1.我國(guó)部分地區(qū)雞星狀病毒病流行病學(xué)調(diào)查本研究自2017～2018年,從江蘇省、安徽省、山東省和廣東省的7個(gè)地區(qū)采集了 195份樣品,進(jìn)行PCR檢測(cè)雞星狀病毒的感染情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,41份成年雞樣本中僅1份陽(yáng)性樣本,陽(yáng)性率為2.44%,而154份1日齡雛雞樣本的陽(yáng)性率高達(dá)82.47%(127/154),綜合陽(yáng)性率為65.64%。測(cè)序結(jié)果分析比對(duì)顯示,陽(yáng)性樣品包含7個(gè)毒株,全部屬于雞星狀病毒。遺傳分析結(jié)果表明,我國(guó)雞群中同時(shí)存在I型和II型雞星狀病毒。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,與以往國(guó)外報(bào)道相似,低日齡雛雞更容易檢測(cè)到病毒,而成年雞檢測(cè)率較低。2.雞II型星狀病毒絕對(duì)定量qRT-PCR檢測(cè)方法的建立到目前為止,尚無(wú)針對(duì)CAstV定量檢測(cè)方法的相關(guān)研究。本研究通過(guò)雞星狀病毒RNA酶依賴的RNA聚合酶(RdRp)基因的研究,成功的建立針對(duì)II型雞星狀病毒絕對(duì)定量qRT-PCR的方法。設(shè)計(jì)了針對(duì)CAstV-RdRp基因特異性的引物并成功制備了陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,利用該方法檢測(cè)病毒在LMH細(xì)胞中增殖情況。結(jié)果表明,CAstV感染LMH細(xì)胞早期雖無(wú)明顯病變,但病毒可以在LMH細(xì)胞中生長(zhǎng)繁殖。本研究建立的檢測(cè)CAstV-RdRp基因絕對(duì)定量PCR方法為研究病毒致病性以及生物學(xué)功能提供了一種檢測(cè)技術(shù)手段。3.雞星狀病毒分離鑒定及全基因組測(cè)序分析為了進(jìn)一步對(duì)國(guó)內(nèi)流行CAstV進(jìn)行更深入的研究,本研究使用雞肝癌細(xì)胞系(LMH)對(duì)CAstV病毒進(jìn)行了分離和鑒定。結(jié)果顯示,病毒可以在LMH細(xì)胞中增殖,并盲傳4代后可產(chǎn)生細(xì)胞病變。利用LMH細(xì)胞分離到了一株CAstV,命名為CAstVNJ1701株,屬于II型雞星狀病毒。隨后對(duì)其近全長(zhǎng)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,結(jié)果得到基因組長(zhǎng)度為7492核苷酸,其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與已發(fā)表的雞星狀病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相似,包括ORF1a、ORF1b和ORF2三個(gè)開(kāi)放閱讀框。將三個(gè)開(kāi)放閱讀框進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果顯示本研究分離的CAstV NJ1701株與CAstV FP3株的同源性較高,通過(guò)ORF2衣殼蛋白分類,可劃分為CAstV B1群;CAstV NJ1701株ORF1a和ORF1b基因序列與其他CAstV的ORF1a和ORF1b序列同源性較低,處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支。4.病毒接種雞胚致病性實(shí)驗(yàn)將分離的病毒通過(guò)卵黃囊接種6日齡雞胚,盲傳4代后發(fā)現(xiàn)雞胚有明顯致弱和致死現(xiàn)象,qRT-PCR檢測(cè)也證實(shí)病毒可以在雞胚中增殖。病毒接種雞胚孵化率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,30枚病毒接種雞胚,僅11雞胚孵化成功,孵化率為36.67%。死亡的雞胚生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)明顯問(wèn)題,呈現(xiàn)侏儒胚現(xiàn)象,說(shuō)明雞星狀病毒感染可以導(dǎo)致雞群孵化率降低。通過(guò)研究?jī)?nèi)容二所建立的方法,檢測(cè)了 RdRp基因在雛雞20個(gè)組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明,CAstV病毒基因雛雞盲腸中表達(dá)量最高,其次是腎臟,而在心臟中表達(dá)量最低,這一結(jié)果為將來(lái)臨床檢測(cè)樣品的采集提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65;S858.31
【圖文】：

逡逑的發(fā)明和檢測(cè)方法的優(yōu)化，星狀病毒的易感動(dòng)物范圍可能會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大（見(jiàn)圖２）邋［２］。逡逑Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ逡逑ｇｅｎｏｇｒｏｕｐｌ邋｜邋＾逡逑Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邐Ｓ邋身署辦逡逑９ｅｎ0９ｒｏｕｐＨ邋＼邋妒 逡逑Ｂａｔ＾�。龠姡澹澹纾澹睿铮纾颍铮酰疱澹桑慑义希具姡龋粒螅簦郑停桑拢戾义希义希停幔恚幔螅簦颍铮觯椋颍酰箦义希纾澹睿铮纾颍铮酰疱澹慑义蠄D２星狀病毒系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋Ａｓｔｒｏ邋ｖｉｒｕｓ逡逑研宄人員根據(jù)感染宿主范圍將星狀病毒科劃分為哺乳動(dòng)物星狀病毒屬和禽星狀病毒逡逑屬［２５］，國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ＩＣＴＶ）又根據(jù)不同病毒衣殼蛋白之間的差異又分為１９種哺逡逑乳動(dòng)物星狀病毒和３種禽星狀病毒。其中禽星狀病毒屬根據(jù)遺傳距離分為：Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邋Ｇ逡逑Ｉ邋．Ａ型，僅包含火雞星狀病毒１型（ＴＡｓｔＶ－１）邋：邋Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邋Ｇ邋Ｉ邋．Ｂ型，包括禽腎炎病毒逡逑１邋型（ＡＮＶ－１）、禽腎炎病毒邋２邋型（ＡＮＶ－２）和雞星狀病毒（ＣＡｓｔＶ）邋；Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邋ＧＩＩ．Ａ逡逑型，包含火雞星狀病毒２型（ＴＡｓｔＶ－２）和鴨星狀病毒（ＤＡｓｔＶ）邋［２６］。禽星狀病毒與哺乳動(dòng)逡逑物星狀病毒基因差異巨大，在最保守的ＲｄＲｐ區(qū)域，禽星狀病毒與人星狀病毒１型（ＨＡｓｔＶ－１）逡逑僅有４０％左右的同源性［２７］。逡逑

２．１．２雞星狀病毒基因組結(jié)構(gòu)及分類逡逑ＣＡｓｔＶ全長(zhǎng)為７．５ｋｂ左右，ＯＲＦｌａ開(kāi)放閱讀框與ＯＲＦｌｂ開(kāi)放閱讀框有部分重合區(qū)域，逡逑ＯＲＦｌｂ開(kāi)放閱讀框與ＯＲＦ２開(kāi)放閱讀框之間存在幾十個(gè)堿基的空隙（圖３）。ＣＡｓｔＶ的逡逑ＯＲＦｌｂ開(kāi)放閱讀框相對(duì)保守，通常用作檢測(cè)病毒的靶基因［４３］。目前，全球發(fā)表的ＣＡｓｔＶ逡逑全基因組序列僅６條，中國(guó)地區(qū)還沒(méi)有ＣＡｓｔＶ分子流行病學(xué)調(diào)查和全基因組序列的相關(guān)報(bào)逡逑道。根據(jù)以往的報(bào)道，ＣＡｓｔＶ存在兩種分類方法，一種是根據(jù)較為保守的ＯＲＦｌｂ開(kāi)放閱讀逡逑框編碼的ＲＮＡ依賴的ＲＮＡ聚合酶部分序列分類為ＣＡｓｔＶ邋Ｉ型和ＣＡｓｔＶ邋ＩＩ型；另一種是逡逑以ＯＲＦ２開(kāi)放閱讀框編碼的衣殼蛋白序列分類為ＣＡｓｔＶＡ型和ＣＡｓｔＶ邋Ｂ型，其中，ＣＡｓｔＶ逡逑

圖１－２邋ＣＡｓｔＶ部分ＲｄＲｐ基因序列同源性分析逡?

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