【摘要】：近年來,禽類星狀病毒對家禽業(yè)的影響受到了世界范圍內(nèi)的廣泛關注。其中雞星狀病毒(Chicken astrovirus,CAstV)可單獨引起雛雞腎炎、腹瀉性腸炎及發(fā)育緩慢等癥狀,是導致雛雞腹瀉、痛風等疾病的重要病原體之一。目前我國雞星狀病毒病分子流行病學調(diào)查的結果還未見公開報道,為了解CAstV在我國雞群中的流行情況,本研究開展了我國部分地區(qū)雞星狀病毒病分子流行病學調(diào)查工作,建立了檢測雞星狀病毒的絕對熒光定量方法,同時還分離了一株雞星狀病毒,為進一步研究雞星狀病毒生物學功能提供了技術手段和生物材料。1.我國部分地區(qū)雞星狀病毒病流行病學調(diào)查本研究自2017～2018年,從江蘇省、安徽省、山東省和廣東省的7個地區(qū)采集了 195份樣品,進行PCR檢測雞星狀病毒的感染情況。實驗結果表明,41份成年雞樣本中僅1份陽性樣本,陽性率為2.44%,而154份1日齡雛雞樣本的陽性率高達82.47%(127/154),綜合陽性率為65.64%。測序結果分析比對顯示,陽性樣品包含7個毒株,全部屬于雞星狀病毒。遺傳分析結果表明,我國雞群中同時存在I型和II型雞星狀病毒。從檢測結果來看,與以往國外報道相似,低日齡雛雞更容易檢測到病毒,而成年雞檢測率較低。2.雞II型星狀病毒絕對定量qRT-PCR檢測方法的建立到目前為止,尚無針對CAstV定量檢測方法的相關研究。本研究通過雞星狀病毒RNA酶依賴的RNA聚合酶(RdRp)基因的研究,成功的建立針對II型雞星狀病毒絕對定量qRT-PCR的方法。設計了針對CAstV-RdRp基因特異性的引物并成功制備了陽性質(zhì)粒標準品,利用該方法檢測病毒在LMH細胞中增殖情況。結果表明,CAstV感染LMH細胞早期雖無明顯病變,但病毒可以在LMH細胞中生長繁殖。本研究建立的檢測CAstV-RdRp基因絕對定量PCR方法為研究病毒致病性以及生物學功能提供了一種檢測技術手段。3.雞星狀病毒分離鑒定及全基因組測序分析為了進一步對國內(nèi)流行CAstV進行更深入的研究,本研究使用雞肝癌細胞系(LMH)對CAstV病毒進行了分離和鑒定。結果顯示,病毒可以在LMH細胞中增殖,并盲傳4代后可產(chǎn)生細胞病變。利用LMH細胞分離到了一株CAstV,命名為CAstVNJ1701株,屬于II型雞星狀病毒。隨后對其近全長基因組進行PCR擴增和測序,結果得到基因組長度為7492核苷酸,其結構特點與已發(fā)表的雞星狀病毒基因組結構特點相似,包括ORF1a、ORF1b和ORF2三個開放閱讀框。將三個開放閱讀框進行遺傳進化分析,結果顯示本研究分離的CAstV NJ1701株與CAstV FP3株的同源性較高,通過ORF2衣殼蛋白分類,可劃分為CAstV B1群;CAstV NJ1701株ORF1a和ORF1b基因序列與其他CAstV的ORF1a和ORF1b序列同源性較低,處于一個相對獨立的分支。4.病毒接種雞胚致病性實驗將分離的病毒通過卵黃囊接種6日齡雞胚,盲傳4代后發(fā)現(xiàn)雞胚有明顯致弱和致死現(xiàn)象,qRT-PCR檢測也證實病毒可以在雞胚中增殖。病毒接種雞胚孵化率實驗結果表明,30枚病毒接種雞胚,僅11雞胚孵化成功,孵化率為36.67%。死亡的雞胚生長發(fā)育出現(xiàn)明顯問題,呈現(xiàn)侏儒胚現(xiàn)象,說明雞星狀病毒感染可以導致雞群孵化率降低。通過研究內(nèi)容二所建立的方法,檢測了 RdRp基因在雛雞20個組織中的表達情況。結果表明,CAstV病毒基因雛雞盲腸中表達量最高,其次是腎臟,而在心臟中表達量最低,這一結果為將來臨床檢測樣品的采集提供依據(jù)。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65;S858.31
【圖文】：

逡逑的發(fā)明和檢測方法的優(yōu)化，星狀病毒的易感動物范圍可能會進一步擴大（見圖２）邋［２］。逡逑Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ逡逑ｇｅｎｏｇｒｏｕｐｌ邋｜邋＾逡逑Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邐Ｓ邋身署辦逡逑９ｅｎ0９ｒｏｕｐＨ邋＼邋妒 逡逑Ｂａｔ＾�。龠姡澹澹纾澹睿铮纾颍铮酰疱澹桑慑义希具姡龋粒螅簦郑停桑拢戾义希义希停幔恚幔螅簦颍铮觯椋颍酰箦义希纾澹睿铮纾颍铮酰疱澹慑义蠄D２星狀病毒系統(tǒng)發(fā)育樹逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋Ａｓｔｒｏ邋ｖｉｒｕｓ逡逑研宄人員根據(jù)感染宿主范圍將星狀病毒科劃分為哺乳動物星狀病毒屬和禽星狀病毒逡逑屬［２５］，國際病毒分類委員會（ＩＣＴＶ）又根據(jù)不同病毒衣殼蛋白之間的差異又分為１９種哺逡逑乳動物星狀病毒和３種禽星狀病毒。其中禽星狀病毒屬根據(jù)遺傳距離分為：Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邋Ｇ逡逑Ｉ邋．Ａ型，僅包含火雞星狀病毒１型（ＴＡｓｔＶ－１）邋：邋Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邋Ｇ邋Ｉ邋．Ｂ型，包括禽腎炎病毒逡逑１邋型（ＡＮＶ－１）、禽腎炎病毒邋２邋型（ＡＮＶ－２）和雞星狀病毒（ＣＡｓｔＶ）邋；Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邋ＧＩＩ．Ａ逡逑型，包含火雞星狀病毒２型（ＴＡｓｔＶ－２）和鴨星狀病毒（ＤＡｓｔＶ）邋［２６］。禽星狀病毒與哺乳動逡逑物星狀病毒基因差異巨大，在最保守的ＲｄＲｐ區(qū)域，禽星狀病毒與人星狀病毒１型（ＨＡｓｔＶ－１）逡逑僅有４０％左右的同源性［２７］。逡逑

２．１．２雞星狀病毒基因組結構及分類逡逑ＣＡｓｔＶ全長為７．５ｋｂ左右，ＯＲＦｌａ開放閱讀框與ＯＲＦｌｂ開放閱讀框有部分重合區(qū)域，逡逑ＯＲＦｌｂ開放閱讀框與ＯＲＦ２開放閱讀框之間存在幾十個堿基的空隙（圖３）。ＣＡｓｔＶ的逡逑ＯＲＦｌｂ開放閱讀框相對保守，通常用作檢測病毒的靶基因［４３］。目前，全球發(fā)表的ＣＡｓｔＶ逡逑全基因組序列僅６條，中國地區(qū)還沒有ＣＡｓｔＶ分子流行病學調(diào)查和全基因組序列的相關報逡逑道。根據(jù)以往的報道，ＣＡｓｔＶ存在兩種分類方法，一種是根據(jù)較為保守的ＯＲＦｌｂ開放閱讀逡逑框編碼的ＲＮＡ依賴的ＲＮＡ聚合酶部分序列分類為ＣＡｓｔＶ邋Ｉ型和ＣＡｓｔＶ邋ＩＩ型；另一種是逡逑以ＯＲＦ２開放閱讀框編碼的衣殼蛋白序列分類為ＣＡｓｔＶＡ型和ＣＡｓｔＶ邋Ｂ型，其中，ＣＡｓｔＶ逡逑

圖１－２邋ＣＡｓｔＶ部分ＲｄＲｐ基因序列同源性分析逡?

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本文編號：2776924