【摘要】：褐黃血蜱是我國(guó)常見(jiàn)蜱種之一,主要侵襲豬、犬、黃牛和刺猬等脊椎動(dòng)物。它攜帶新布尼亞病毒、蜱傳腦炎病毒和立克次體等多種病原體,具有潛在公共衛(wèi)生意義。為篩選功能蛋白分子,探索新的控蜱方案,本研究采用LC-MS/MS技術(shù)分析褐黃血蜱中腸內(nèi)容物主要蛋白組分,選定熱休克蛋白70家族作為本研究?jī)?nèi)容;從褐黃血蜱唾液腺和中腸轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)搜索出熱休克蛋白70 Unigenes,以RACE法進(jìn)行全長(zhǎng);以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析該家族五個(gè)成員在半飽血和飽血褐黃血蜱雌成蟲(chóng)唾液腺內(nèi)的表達(dá)水平;以pGEX-4T-1制備HSP70-8重組蛋白,通過(guò)凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)和纖維蛋白原(FIB)凝血時(shí)間分析其抗凝活性及機(jī)制。主要結(jié)果如下:1.在褐黃血蜱中腸內(nèi)容物中檢出特異性肽段131個(gè),鑒定蛋白102種,其中高可信度蛋白16種。從褐黃血蜱中腸轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中搜出高可信度蛋白同源Unigene 24條,其中,9條Unigene編碼的多肽為蛋白完整序列,其他均為蛋白的部分序列。目前僅能確定三種高可信度蛋白Vitellogenin-1、Vitellogenin-2和Histone H4由雌蜱分泌。2.從褐黃血蜱唾液腺和中腸轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中搜出被注釋為熱休克蛋白70的Contig8235、Contig8804、Contig4468、Contig4254和Contig2393,以RACE法克隆獲得四個(gè)熱休克蛋白70 cDNA全長(zhǎng),即KY249381.1、KY678393.1、KY249380.1和KY249379.1,分別編碼蛋白HSP70-2a、HSP70-2b、HSP70-5和HSP70-9。3.以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析可知,熱休克蛋白70家族五個(gè)成員在半飽血狀態(tài)唾液腺的表達(dá)水平均高于在飽血狀態(tài)唾液腺的表達(dá)水平,其中,HSP70-5、HSP70-8和HSP70-9差異顯著(p0.01);在半飽血狀態(tài)唾液腺內(nèi),相對(duì)表達(dá)量為HSP70-9HSP70-8HSP70-5HSP70-2aHSP70-2b;而在飽血狀態(tài)唾液腺內(nèi),相對(duì)表達(dá)量為HSP70-8HSP70-9HSP70-5HSP70-2bHSP70-2a。4.以褐黃血蜱HSP70-8-ORF插入pGEX-4T-1構(gòu)建重組載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),以IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá);經(jīng)SDS-PAGE和Western-blotting法鑒定,成功獲得相對(duì)質(zhì)量為100 kDa的褐黃血蜱HSP70-8重組蛋白。5.HSP70-8重組蛋白能顯著延長(zhǎng)凝血酶時(shí)間(TT)(p0.01)和纖維蛋白原(FIB)凝血時(shí)間(300s),但對(duì)凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)無(wú)影響,證明該蛋白具有抗凝血活性。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.746
【圖文】：

virus[42]；Yun 等人在該蜱檢出了新布尼亞病毒（SFTSV）、蜱傳腦炎病毒（T漿體（Anaplasma）等病原體[43]。蜱類消化特點(diǎn)和抗凝的重要性 蜱類以吸血為生蜱類的一個(gè)生活周期包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱四個(gè)階段，除卵期外，其他均須叮咬宿主、充分吸血才能完成進(jìn)一步發(fā)育。硬蜱的各活動(dòng)期均僅吸血一血時(shí)間較長(zhǎng)，通常幼蟲(chóng)、若蟲(chóng)和雌蟲(chóng)吸血時(shí)間分別為 2～7、3～8 和 6～15后體重分別增加 10～20、20～100 和 50～250 倍。 抗凝是蜱類消化血餐的意義蜱類的消化系統(tǒng)主要由唾液腺和口器、咽峽、食管、中腸、小腸、直腸囊、等組成，其中，中腸是蜱消化血餐和吸收養(yǎng)分的主要部位。與其他動(dòng)物不同行細(xì)胞內(nèi)消化，這是一種十分獨(dú)特的消化方式。蜱類消化血餐的過(guò)程見(jiàn)圖 1

蜱類唾液中的主要抗凝分子及其作用機(jī)制見(jiàn)圖 1-2。圖1-2 蜱類唾液蛋白的抗凝機(jī)制（Chmelar et al. 2012）Fig.1-2Anticoagulant mechanisms of tick salivary proteins (Chmelar et al. 2012)

CTD），相對(duì)質(zhì)量為 10 kDa 左右，約包含 100 個(gè)氨基酸殘基且序列不保守前其生理功能尚不明確。從 HSP70 的立體結(jié)構(gòu)看，其 NBD 由四個(gè)結(jié)構(gòu)亞區(qū)組成葉，兩葉之間即為 ATP 結(jié)合位點(diǎn)；SBD 包含兩個(gè)亞區(qū)，中間呈袋狀，形成底物位點(diǎn)，SBD 與 NBD 之間通過(guò)一段鉸鏈區(qū)連接；在 CTD 區(qū)域，肽鏈形成“蓋子構(gòu)，能阻止已結(jié)合的底物脫離[103]。除 NBD、SBD 和 CTD 三個(gè)功能域外，HSP70 家族成員均含有不同的定位序SP70-5 和 HSP70-9 等家族成員在 N- 末端具有定位信號(hào)（Localization signal），其蛋白質(zhì)分子的細(xì)胞間區(qū)域；HSP70-1a、HSP70-1b、HSP70-1t、HSP70-2、HSP70SC70 等蛋白分子的 C- 末端均有特殊定位基序（motif）EEVD，表明它們都定位胞質(zhì)/細(xì)胞核（Nu/Cyto）；HSP70-5 蛋白分子的 C- 末端含有滯留信號(hào)（Retengnal）KEDL，可以阻止該蛋白離開(kāi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[104]。已經(jīng)證明，HSP70 家族的亞細(xì)胞不相同，它們?cè)诓煌項(xiàng)l件下發(fā)揮的生物學(xué)功能也不同[105]�？偨Y(jié)人類 HSP70的已知結(jié)構(gòu)域見(jiàn)圖 1-3。

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本文編號(hào)：2777497