發(fā)布時(shí)間：2020-07-31 19:22

【摘要】：在本實(shí)驗(yàn)室前期肉雞全體內(nèi)自然飼喂試驗(yàn)和體外原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞試驗(yàn)研究磷吸收成果的基礎(chǔ)上,本論文通過如下三個(gè)試驗(yàn),進(jìn)一步研究磷在正常與相關(guān)磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因沉默的原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收及相關(guān)磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá),以初步揭示肉雞十二指腸磷吸收的分子機(jī)制。試驗(yàn)一研究不同磷濃度下原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的磷吸收及相關(guān)磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)。采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì),設(shè)0、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L共5個(gè)不同磷濃度孵育水平處理組,每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù),孵育時(shí)間為87 min(由本實(shí)驗(yàn)室前期體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果確定)。結(jié)果表明,不同磷孵育水平對十二指腸上皮細(xì)胞磷吸收率有顯著影響(P0.05),十二指腸上皮細(xì)胞磷吸收率隨著磷孵育水平的增加而增加;與對照組相比,磷孵育水平為4 mmol/L時(shí)顯著降低了IIb型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)載體(Type IIb Sodium-Phosphate Cotransporter,NaP-IIb)和無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(Inorganic Phosphate Transporter 1,PiT-1)mRNA表達(dá)水平(P0.05),而磷孵育水平為0.5和2 mmol/L時(shí),NaP-IIb、PiT-1和PiT-2 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化(P0.05);磷孵育水平對NaP-IIb、PiT-1和PiT-2蛋白表達(dá)水平均無顯著影響(P0.05)。上述結(jié)果表明,以上磷孵育水平(0.5-4 mmol/L)對磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)均偏高,故在下面的試驗(yàn)三中需進(jìn)一步降低磷孵育水平。試驗(yàn)二分別研究不同siRNA序列對NaP-Ⅱb和PiT-2(由本實(shí)驗(yàn)室前期全體內(nèi)肉雞試驗(yàn)結(jié)果確定)的沉默效率,以篩選獲得沉默效率最高的siRNA序列。篩選NaP-Ⅱb或PiT-2 siRNA試驗(yàn)均采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。篩選NaP-Ⅱb-siRNA試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理組,即空白對照組(未轉(zhuǎn)染siRNA)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性siRNA)及2個(gè)NaP-Ⅱb-siRNA處理組(轉(zhuǎn)染NaP-Ⅱb-siRNA1372和1416),每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù);篩選PiT-2-siRNA試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理組,即空白對照組(未轉(zhuǎn)染siRNA)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性siRNA)及3個(gè)PiT-2-siRNA處理組(轉(zhuǎn)染PiT-2-siRNA890、996和1217),每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明,與空白對照和陰性對照組比,兩個(gè)轉(zhuǎn)染NaP-Ⅱb-siRNA處理組均在mRNA水平上降低了NaP-Ⅱb的表達(dá),降低水平約為65%,但沒有顯著差異(P0.10);在蛋白表達(dá)水平上也無顯著差異(P0.10),但轉(zhuǎn)染NaP-Ⅱb-siRNA1372的蛋白表達(dá)量更低。3個(gè)轉(zhuǎn)染PiT-2-siRNA處理組中,PiT-2-siRNA890顯著降低了PiT-2 mRNA表達(dá)水平(P0.10),降低水平約為80%,在蛋白表達(dá)水平上無顯著差異(P0.10);另外兩個(gè)PiT-2-siRNA處理組在mRNA和蛋白表達(dá)水平上均沒有顯著差異(P0.10)。因此,選擇NaP-Ⅱb-siRNA1372和PiT-2-siRNA890進(jìn)行以下試驗(yàn)三研究。試驗(yàn)三采用siRNA干擾技術(shù),研究磷在正常與NaP-Ⅱb和PiT-2表達(dá)分別沉默的原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收,以揭示NaP-Ⅱb和PiT-2是否直接參與了肉雞十二指腸上皮細(xì)胞磷的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。NaP-Ⅱb和PiT-2基因沉默試驗(yàn)均采用2×2兩因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。2個(gè)siRNA處理組分別為:轉(zhuǎn)染NaP-Ⅱb-siRNA1372或PiT-2-siRNA890處理組及空白對照組,2個(gè)磷孵育水平分別為0和0.25 mmol/L。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明,磷孵育水平對原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞NaP-Ⅱb mRNA和蛋白表達(dá)水平均無顯著影響(P0.10),但siRNA1372特異性沉默NaP-IIb基因后顯著降低了其NaP-Ⅱb mRNA的表達(dá)(P0.10),而對其蛋白表達(dá)水平無顯著影響(P0.10)。磷孵育水平與是否轉(zhuǎn)染siRNA的互作對原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞磷吸收率有顯著影響(P0.10)。在0.25 mmol/L磷孵育水平下,與空白對照組相比,siRNA1372轉(zhuǎn)染組顯著降低了十二指腸上皮細(xì)胞的磷吸收率。以上結(jié)果表明,由于siRNA特異性抑制了原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞NaP-Ⅱb mRNA的表達(dá),進(jìn)而降低了細(xì)胞對磷的吸收。磷孵育水平顯著提高了原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞PiT-2蛋白表達(dá)水平及磷吸收率(P0.10)。siRNA890特異性沉默PiT-2基因?qū)iT-2蛋白表達(dá)水平及磷吸收率無顯著影響(P0.10)。磷孵育水平與是否轉(zhuǎn)染siRNA的互作對PiT-2 mRNA表達(dá)有顯著影響(P0.10)。在0.25 mmol/L磷孵育水平下,與空白對照組相比,siRNA890轉(zhuǎn)染組顯著降低了PiT-2 mRNA表達(dá)水平(P0.10)。以上結(jié)果表明,抑制原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞PiT-2 mRNA表達(dá)并不影響細(xì)胞對磷的吸收。綜上所述,NaP-Ⅱb可能直接參與了原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞磷的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收,而PiT-2可能并未參與其磷的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S831.5
【圖文】：

A：培養(yǎng) 24 h (20×) B：培養(yǎng) 48 h (20×)A：Cultivated 24 h (20×) B：Cultivated 48 h (20×)圖 2-1 十二指腸上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Figure 2-1 Morphological observation of duodenal epithelial cells在細(xì)胞培養(yǎng)的 24 h 和 48 h，由圖 2-1 中的 A 和 B 可知，十二指腸上皮細(xì)胞貼壁均，且細(xì)胞之間界限清晰，排列緊密。.2 肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞吸收模型的評(píng)估結(jié)果列于表 2-3。由表 2-3 可見，在細(xì)胞分別培養(yǎng) 24 h 和 48 h 時(shí)，TEER 值均高于 3透過率均小于 5%，LDH 活力處于較低水平。但 48 h 的 TEER 值與酚紅透過率同 顯著（P㩳0.05）。因此，在培養(yǎng) 48 h 細(xì)胞進(jìn)行磷吸收率試驗(yàn)。表 2-3 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)原代培養(yǎng)十二指腸上皮細(xì)胞吸收模型的評(píng)估1Table 2-3 Evaluation of absorption model in primary duodenal epithelial cells at different culture 培養(yǎng)時(shí)間 (h)Culture time (h)TEER 值 (Ω·cm2)TEER value (Ω·cm2)酚紅透過率（%）Phenol red transmittance (%)LDH 活力（LDH activit24 327 1.28 25848 446 1.06 270合標(biāo)準(zhǔn)誤 Pooled SE 4.78 0.07 3.6

磷水平的顯著影響（P＞0.05）。其中代表性蛋同磷濃度對原代培養(yǎng)十二指腸細(xì)胞中 NaP-IIb、PiT-1 和f different phosphorus concentrations on the protein expresprimary duodenal epithelial cells1ol/L）tion levelNaP-IIb 蛋白2NaP-IIb protein (RQ)2PiT-1 蛋PiT-1 protei1.00 1.000.95 0.960.94 0.981.03 1.040.86 1.15led SE 0.05 0.05e 0.36 0.08值（n=6)。ans of 6 replicates (n=6). 和 PiT-2 蛋白表達(dá)是以 GAPDH 的蛋白表達(dá)水平為基礎(chǔ)的相對數(shù)值as used to normalize the expression of the NaP-IIb、PiT-1 and PiT-2as a calibrator of 1.A B C D Eb

第三章 篩選沉默十二指腸上皮A 對原代培養(yǎng)十二指腸細(xì)胞中 NaP-Ⅱb mRf different siRNAs on NaP-IIb mRNA expresNaP-Ⅱb mRNA (RQ)2up 1.00 roup 0.95 0.36 0.32 0.29 0.26 cates (n=3).參基因 β-actin 和 GAPDH mRNA 的幾何平均數(shù)的比RNA abundance to β-actin 和 GAPDH mRNA abundan calibrator of 1.DH 的蛋白表達(dá)水平為基礎(chǔ)的相對數(shù)值，并將空白對ormalize the expression of the PiT-2 protein, and the aveA B C Db7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張欣,卜曉波,王英,韓彥龍;細(xì)胞的原代培養(yǎng)[J];牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1999年02期

2 焦曉蓉;成年大鼠鼻咽及鼻腔上皮組織原代培養(yǎng)及生物學(xué)特性初步探討(簡報(bào))[J];中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1988年01期

3 郭娟霞,陳慶林;成年心房肌細(xì)胞的原代培養(yǎng) Ⅰ.成年大鼠心房肌細(xì)胞肌原纖維及微管的動(dòng)態(tài)變化[J];湖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1988年01期

4 蔡永庭,錢(艸耕)蓀,瞿永華;鴨肝細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)[J];腫瘤;1988年06期

5 郭畹華;林啟祥;;膠質(zhì)細(xì)胞成熟因子支持原代培養(yǎng)的小腦皮質(zhì)神經(jīng)元的生存[J];解剖學(xué)報(bào);1989年01期

6 田復(fù)明;漆松濤;竇長武;鞠海濤;陳波;趙力群;;人腦多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤原代培養(yǎng)及生長特性觀察[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2014年18期

7 楊克禮;田永祥;梁望旺;段正贏;劉澤文;郭銳;周丹娜;袁芳艷;;豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)[J];國外畜牧學(xué)(豬與禽);2011年04期

8 劉愷鳴;遲路湘;魯向輝;何國祥;;大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年20期

9 周莉;肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及其分離鑒定與原代培養(yǎng)[J];中國肺癌雜志;2003年03期

10 涂明利,陳雙鄖,王衛(wèi)民,陳霞萍,曹樹軍;人腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定[J];鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2002年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 謝冬;翟成凱;劉影影;張彬彬;吳衛(wèi)東;;人支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的優(yōu)化與鑒定[A];2017環(huán)境與公共健康學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì)環(huán)境醫(yī)學(xué)與健康分會(huì)、中國毒理學(xué)會(huì)生化與分子毒理專業(yè)委員會(huì)2017年年會(huì)論文集[C];2017年

2 胡�？�;耿召華;祝善俊;劉玉峰;;新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定[A];全國第十三屆心臟學(xué)會(huì)、第十六屆心功能專業(yè)委員會(huì)和《心臟雜志》編委會(huì)聯(lián)合學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議紀(jì)要[C];2013年

3 鄭倆燕;許榮華;倪志;姚茂忠;蔡美華;王琰;陳志斌;;Aβ肽損傷原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元COX-2的表達(dá)及其意義[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

4 許杰華;胡海濤;錢亦華;;依布硒啉對原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元作用的研究[A];全面建設(shè)小康社會(huì)：中國科技工作者的歷史責(zé)任——中國科協(xié)2003年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下）[C];2003年

5 相蕾;宋毅軍;;外源性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子抑制原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)第十次全國腦電圖與癲癇診治進(jìn)展高級(jí)講授班及學(xué)術(shù)研討會(huì)日程冊&論文匯編[C];2015年

6 張偉平;聶占國;代中明;;人結(jié)腸上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)[A];2012中國消化系疾病學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2012年

7 王昌明;廖運(yùn)學(xué);蔣明;呂倩;王會(huì)娟;;凍存法的改良原代培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——2013第十四次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

8 趙文然;張中海;鐘照華;;B組柯薩奇病毒在原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞中的持續(xù)感染[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第九次會(huì)員代表大會(huì)暨青年學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2007年

9 隋建麗;羅瑛;周平坤;鐵軼;張?jiān)?;人胚肺細(xì)胞的原代培養(yǎng)、生物學(xué)特性觀察及初步應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)分會(huì)第二次中青年專題研討會(huì)論文匯編[C];1999年

10 劉士德;陳蓮鳳;閆倫飆;宋國興;司靜懿;李昆;麥永嫣;;原代培養(yǎng)的正常人宮頸鱗狀上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)[A];第八次全國電子顯微學(xué)會(huì)議論文摘要集（Ⅰ）[C];1994年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 谷莉;小腦顆粒神經(jīng)元去極化誘導(dǎo)的上皮生長因子受體間接激活信號(hào)傳導(dǎo)途徑是由谷氨酸受體所介導(dǎo)[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

2 范華;蛋氨酸亞砜還原酶A在原代培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活中的作用及其機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2014年

3 吳志軒;神經(jīng)生長因子對原代培養(yǎng)Cajal間質(zhì)細(xì)胞的作用研究[D];武漢大學(xué);2009年

4 楊靜文;3，5，3’-三碘甲狀腺原氨酸對有絲分裂后神經(jīng)元的影響[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2012年

5 張雪琴;細(xì)胞治療生長板損傷的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

6 章楊;人嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)及細(xì)胞分泌功能的相關(guān)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

7 張浩;胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞源生長因子和趨化因子的高通量篩選和驗(yàn)證[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

8 祁愛群;糖皮質(zhì)激素對原代培養(yǎng)的海馬細(xì)胞中絲裂原激活蛋白激酶的快速激活作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

9 田鳳艷;戊二酸致大鼠腦神經(jīng)元毒性作用的機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2010年

10 吳國民;口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤干細(xì)胞的分選和鑒定[D];吉林大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 呂娜;磷在正常與相關(guān)基因沉默的原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

2 李栩琳;Militarine對原代培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的促分化作用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

3 張樹敏;磷在原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收及相關(guān)磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

4 王玉祥;原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞電離輻射效應(yīng)的初步研究[D];蘇州大學(xué);2001年

5 熊東;絞股藍(lán)皂苷對原代培養(yǎng)胚鼠中腦多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

6 周曉濤;泡球蚴囊液對原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞增殖影響的初步研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2008年

7 宋德偉;昆蟲細(xì)胞的建庫技術(shù)研究及昆蟲細(xì)胞的原代培養(yǎng)[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2004年

8 樊怡;己糖激酶在原代培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)與調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2002年

9 梁穎;內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)和伊曲替酸調(diào)控的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2006年

10 魏玉玲;mPGES-1-PGE_2-EP_(1-4)通路參與原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元鋁鹽損傷機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2776898