【摘要】：乳脂是牛乳中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一,也是乳品質(zhì)和飼養(yǎng)效率的重要衡量指標(biāo),探索奶牛乳脂合成規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制為國(guó)際反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)科所關(guān)注。奶牛乳腺炎是一種奶牛乳腺組織的炎癥變化,伴有乳汁生理和化學(xué)的變化。乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)病率最高、流行最快、造成損失最為嚴(yán)重的疾病之一,病原微生物是引起奶牛乳腺炎的主要因素之一,金黃色葡萄球菌是最為常見(jiàn)的接觸性乳腺炎病原菌,具有入侵乳腺上皮細(xì)胞的能力。目前對(duì)金黃色葡萄球菌入侵奶牛乳腺上皮細(xì)胞對(duì)乳脂合成的影響及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本文通過(guò)原代培養(yǎng),分離并純化奶牛乳腺上皮細(xì)胞作為研究模型,利用高清晰度激光共聚焦顯微鏡觀察金黃色葡萄球菌入侵引起的細(xì)胞骨架重排,菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定侵入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量,ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中甘油三酯(TAG)、軟脂酸(PA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量變化,質(zhì)譜測(cè)定細(xì)胞內(nèi)37種脂肪酸的累積;同時(shí),采用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mTORC1信號(hào)通路活性、乳脂合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵酶的表達(dá)變化,免疫共沉淀和酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證與乳脂合成相關(guān)的蛋白分子之間的相互作用關(guān)系,為闡明金黃色葡萄球菌入侵引起的乳脂合成紊亂的分子機(jī)制提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1)金黃色葡萄球菌入侵牛乳腺上皮細(xì)胞2 h激光共聚焦顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞骨架排列發(fā)生變化;2)隨著入侵時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量增加;3)光學(xué)顯微鏡下觀察,隨著入侵時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)改變并伴隨細(xì)胞數(shù)量減少;4)金黃色葡萄球菌入侵牛乳腺上皮細(xì)胞4h~16 h,細(xì)胞培養(yǎng)液中TAG、PA和DHA含量顯著降低(p0.05),細(xì)胞內(nèi)mTORC1信號(hào)通路活性、轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和SREBP1表達(dá)以及關(guān)鍵酶Lipin1、ACC和FAS表達(dá)呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì);5)細(xì)菌入侵細(xì)胞8 h細(xì)胞內(nèi)脂肪酸總量、飽和脂肪酸及不飽和脂肪酸含量均顯著降低(p0.05),細(xì)菌入侵影響了細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的合成;6)通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)、免疫共沉淀和酵母雙雜交驗(yàn)證,證明Lipin1與PPARγ具有直接相互作用關(guān)系,且二者之間有372種共同的結(jié)合蛋白,生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其中108種蛋白構(gòu)成相互作用網(wǎng)絡(luò);7)通過(guò)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)出的327種共同結(jié)合蛋白的人工篩選,注意到Q95KV1是IKKα的內(nèi)源性抑制劑,進(jìn)而通過(guò)Western Blot在以anti-Lipin1和anti-PPARγ為誘餌抗體的免疫共沉淀復(fù)合物中檢測(cè)到了IKKβ和IκBα,由此使得乳脂合成相關(guān)的Lipin1和PPARγ與炎癥相關(guān)的功能蛋白IKKβ和IκBα聯(lián)系起來(lái)。總之,通過(guò)本文實(shí)驗(yàn)我們證明金黃色葡萄球菌入侵牛乳腺上皮細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排,細(xì)胞變形和裂解,影響乳脂合成;隨著細(xì)菌入侵時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)細(xì)胞內(nèi)mTORC1信號(hào)通路活性和乳脂合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及關(guān)鍵酶的表達(dá)影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);Lipin1與PPARγ具有直接的相互作用關(guān)系并且與炎癥相關(guān)的功能蛋白相關(guān)聯(lián),為下一步研究脂質(zhì)代謝與炎癥反應(yīng)關(guān)系提供了依據(jù)。論文通過(guò)構(gòu)建乳房炎細(xì)胞模型,確定金黃色葡萄球菌入侵對(duì)乳脂合成的影響并初步探討了可能的分子機(jī)制,將對(duì)闡明奶牛乳房炎發(fā)病機(jī)制,提高乳品質(zhì)量,提高奶業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S858.23
【圖文】：

內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文9圖1.1 乳脂合成基因網(wǎng)絡(luò)(Bionaz and Loor, 2008)Fig 1.1 Networks among genes involved in milk fat synthesis5.4 脂肪酸合成相關(guān)酶脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)一種多功能復(fù)合酶，廣泛參與脂肪酸合成的各階段，是脂肪酸合成過(guò)程中的限速酶，無(wú)明顯的組織特異性，廣泛分布動(dòng)物體內(nèi)脂肪和肝臟等組織中，可催化乙酰輔酶A從頭合成長(zhǎng)鏈硬脂酸。是飽和與不飽和脂肪酸的合成的底物基礎(chǔ)。動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸合成酶的活性與多種指標(biāo)相關(guān)，包括體內(nèi)脂肪酸的合成和體脂的沉積，另外其還廣泛參與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[95]、膜結(jié)構(gòu)[96]、蛋白質(zhì)的乙�；^(guò)程[97]。FAS是脂質(zhì)代謝基因中唯一一個(gè)具有適應(yīng)性進(jìn)化特征的基因[98]。乙酰輔酶 A 羧化酶(Acetyl-CoAcarboxylases，ACCs)與FAS都是動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸合成的限速酶，ACC是分子間羧化轉(zhuǎn)移家族成員之一

因此需要培養(yǎng)并分離得到較純的乳腺上皮細(xì)胞作為之后的研究材料。根據(jù)細(xì)胞對(duì)于胰酶的敏感度不同從而對(duì)于原代培養(yǎng)出的混合細(xì)胞進(jìn)行差異消化、分離純化，經(jīng)過(guò)多次消化傳代，得到較純的乳腺上皮細(xì)胞系(圖2.1)。3.2 金黃色葡萄球菌入侵 BMECs 導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞時(shí)能夠引起細(xì)胞骨架重排，本實(shí)驗(yàn)用金黃色葡萄球菌入侵BMECs細(xì)胞，共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架的重排。實(shí)驗(yàn)設(shè)置2組，對(duì)照組（Control）與細(xì)菌入侵組。圖2.1 從乳腺組織中分離得到的牛乳腺上皮細(xì)胞Fig.2.1 Bovine mammary epithelial cells (BMECs) obtained from mammary gland separationA: 組織塊分離法分離出奶牛乳腺上皮細(xì)胞12天；B：組織塊分離法分離出奶牛乳腺上皮細(xì)胞14天（黑色部分為組織塊）；C：組織塊分離法分離出奶牛成纖維細(xì)胞16天（黑色部分為組織塊）；D：消化傳代得到較純奶牛乳腺上皮細(xì)胞。結(jié)果代表四次獨(dú)立性實(shí)驗(yàn)(n=4)A: The tissue separation method separated the BMECs for 12 days (the black part is the block); B: Thetissue separation method separated the BMECs for 14 days (the black part is the block); C: The tissueseparation method separated the BMECs for 16 days (the black part is the block); D: Using differentialtrypsinization obtaine

其中細(xì)菌入侵組使用的入侵比為MOI=30:1，入侵時(shí)間為2 h，用熒光素探針標(biāo)記鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色，用DAPI對(duì)細(xì)胞核染色，用醋酸羥基熒光素（CFDA）對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行染色，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，結(jié)果如圖2.2，2.3所示。對(duì)照組中，BMECs細(xì)胞骨架整齊排列，而細(xì)菌入侵組BMECs細(xì)胞中細(xì)胞骨架發(fā)生解聚，細(xì)胞骨架重排的細(xì)胞數(shù)居多。因此金黃色葡萄球菌入侵BMECs會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排。圖2.2 共聚焦顯微鏡觀察牛乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞骨架（400×）Fig 2.2 The cytoskeleton in BMECs by confocal (400×)Alexa Fluor 594 Phalloidin鬼筆環(huán)肽染色肌動(dòng)蛋白(A、D、G)，DAPI染色細(xì)胞核(B、E、H)，疊加圖(C、F、G)。結(jié)果代表三次獨(dú)立性實(shí)驗(yàn)(n=3)。Actin was stained with Alexa Fluor 594 Phalloidin(A、D、G), nucleus was stained with DAPI(B、E、H)

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王貞;周威;張浩;胡梁斌;莫海珍;金黃色葡萄球菌基因組編輯技術(shù)[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);年期

2 張潔;許喜林;鄒彥桐;翁文川;;金黃色葡萄球菌在廣式燒臘制品中生長(zhǎng)與控制的研究[J];中國(guó)釀造;2018年09期

3 潘巖享;李建平;;小兒金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)型克林霉素耐藥的檢測(cè)[J];浙江檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2007年03期

4 索標(biāo);李森;張偉;侯金會(huì);李真;黃忠民;艾志錄;;脈沖強(qiáng)光對(duì)饅頭表面金黃色葡萄球菌的殺菌效果[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2018年07期

5 史昕平;陸利霞;熊曉輝;;南京部分地區(qū)食品中金黃色葡萄球菌污染狀況調(diào)查[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2018年04期

6 邱杰;蘇明寬;吳海英;;葡萄球菌A蛋白快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的臨床監(jiān)測(cè)與研究[J];臨床合理用藥雜志;2018年11期

7 孟云;馬俊偉;廖超;張凱莉;田會(huì)麗;糜唯鈺;姬華;王周平;;涼皮中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立[J];現(xiàn)代食品科技;2018年04期

8 曾云祥;林高貴;梁世周;金曉立;羅堅(jiān);張燦;黃友澤;許建平;;攜帶殺白細(xì)胞素基因金黃色葡萄球菌臨床感染菌株的回顧性研究[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2017年02期

9 國(guó)譯丹;楊祖順;古文鵬;湯曉召;鄒顏秋碩;劉海霞;范璐;;云南省食源性金黃色葡萄球菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型分析[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2017年10期

10 吳德英;;金黃色葡萄球菌的藥敏實(shí)驗(yàn)[J];大家健康(學(xué)術(shù)版);2016年11期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 胡辛蘭;陳發(fā)林;;院內(nèi)感染金黃色葡萄球菌的分布及耐藥性分析[A];第四屆中國(guó)臨床微生物學(xué)大會(huì)暨微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2013年

2 李正軍;;醫(yī)院金黃色葡萄球菌的分布及耐藥性分析[A];紀(jì)念中國(guó)微生物學(xué)會(huì)臨床微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)成立五周年-第五屆中國(guó)臨床微生物學(xué)大會(huì)暨臺(tái)灣海峽兩岸微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2014年

3 劉倩;郭大文;;醫(yī)院金黃色葡萄球菌的分布及耐藥性分析[A];第六屆中國(guó)臨床微生物學(xué)大會(huì)暨微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2015年

4 范錦戴;申曉晨;馬若瑤;馮嘉琪;麥凱杰;曾志良;馬靜云;;一株金黃色葡萄球菌噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[A];中國(guó)豬業(yè)科技大會(huì)暨中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2015年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2015年

5 溫順航;吳滬軍;林立;李昌崇;;兒童金黃色葡萄球菌播散感染臨床特點(diǎn)分析[A];2014年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨兒內(nèi)科疾病診治新進(jìn)展國(guó)家級(jí)繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2014年

6 鄒明祥;范學(xué)工;劉文恩;李憲;武文君;;金黃色葡萄球菌耐藥性分析及脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)成立30周年慶典大會(huì)資料匯編[C];2009年

7 吳澤剛;李艷;吳青;汪明;顧劍;胡慧霞;徐萬(wàn)洲;;熒光原位雜交法(FISH)快速檢測(cè)尿液中金黃色葡萄球菌[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床檢驗(yàn)管理專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第六屆全國(guó)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

8 王良興;;金黃色葡萄球菌致病性研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[A];2011年第三十三屆浙江省呼吸系病學(xué)術(shù)年會(huì)暨呼吸疾病診治新進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2011年

9 Jie Li;Yu Luo;Na Liu;Hongmei Zhang;;RT-PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌活菌(英文)[A];第三屆特種醫(yī)學(xué)暨山東-河南-湖北三省聯(lián)合微生態(tài)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

10 單璐;童宇峰;馮銀鋼;王金鳳;;金黃色葡萄球菌核酸酶無(wú)脯氨酸突變體的溶液結(jié)構(gòu)及骨架動(dòng)態(tài)特性研究[A];第十三屆全國(guó)波譜學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 郭靜 通訊員 田乃偉;臉上的痘痘不可隨便亂擠[N];廣東科技報(bào);2017年

2 Kate Baggaley 賴博;抗生素治療失效后[N];北京科技報(bào);2017年

3 本報(bào)記者 王嘉;加拿大雞肉韓國(guó)魚(yú)片因金黃色葡萄球菌污染被召回[N];中國(guó)質(zhì)量報(bào);2017年

4 云無(wú)心;如何遠(yuǎn)離金黃色葡萄球菌及其毒素[N];中國(guó)食品安全報(bào);2016年

5 記者 桂運(yùn)安;金黃色葡萄球菌入侵細(xì)胞新機(jī)制[N];安徽日?qǐng)?bào);2014年

6 記者 白毅;金黃色葡萄球菌ClpP調(diào)控機(jī)制被闡明[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2011年

7 印高樂(lè);金黃色葡萄球菌是異位性皮膚炎過(guò)敏原[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

8 侯震;金黃色葡萄球菌致中毒[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2000年

9 記者 白毅;金黃色葡萄球菌感染宿主“幫兇”被找到[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2014年

10 亓欣欣 黃寬偉;中毒罪魁:金黃色葡萄球菌[N];南方日?qǐng)?bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 姜秋;金黃色葡萄球菌PSMs的調(diào)控機(jī)制解析及毒性因子的篩選[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2017年

2 周義正;荊州地區(qū)金黃色葡萄球菌流行的特征及分子分型研究[D];武漢大學(xué);2015年

3 崔俊昌;金黃色葡萄球菌耐藥突變選擇窗的體內(nèi)外研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2005年

4 王小紅;金黃色葡萄球菌B型腸毒素的溶液構(gòu)象及菌體生長(zhǎng)環(huán)境效應(yīng)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

5 李朝霞;喹諾酮藥物對(duì)金黃色葡萄球菌體內(nèi)體外耐藥突變選擇作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2007年

6 楊宏軍;奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌毒力因子的克隆表達(dá)及生物活性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

7 向華;厚樸酚抗金黃色葡萄球菌作用機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2010年

8 胡園園;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的核酸檢測(cè)方法研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢病毒研究所);2016年

9 王登峰;奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測(cè)、分子分型和耐甲氧西林菌株全基因組測(cè)序[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

10 關(guān)正萍;豬肉中五種致病菌多重PCR快速檢測(cè)方法及金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 孫崢;金黃色葡萄球菌的毒力基因檢測(cè)及耐藥性分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2018年

2 趙凌;金黃色葡萄球菌、大腸桿菌對(duì)BMEC主要炎性因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 李穗霞;食源性金黃色葡萄球菌luxS基因缺失對(duì)環(huán)境耐受性及致病性的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

4 田賽;基于免疫磁分離及化學(xué)發(fā)光快速檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌B型腸毒素[D];天津理工大學(xué);2018年

5 陳佳佳;感染金黃色葡萄球菌后小尾寒羊乳腺組織及外周血中TLRs和CK的表達(dá)[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

6 王禮;小檗堿抗金黃色葡萄球菌的機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2018年

7 敬鷗;不同濃度外洗止癢方對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2018年

8 陳曉青;金黃色葡萄球菌耐藥性及ε-PL對(duì)其生物膜形成的影響[D];甘肅中醫(yī)藥大學(xué);2018年

9 李可可;金黃色葡萄球菌表面蛋白表達(dá)基因ebh分子流行特征及致病性研究[D];甘肅中醫(yī)藥大學(xué);2018年

10 馮雪;金黃色葡萄球菌入侵牛乳腺上皮細(xì)胞對(duì)乳脂合成的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2776818