【摘要】：羊無(wú)漿體(Anaplasma ovis)感染綿羊、山羊和一些野生反芻動(dòng)物,引起無(wú)漿體病。主要表面蛋白(Major Surface Proteins,MSPs)是其外膜蛋白,也是重要抗原。為分析其持續(xù)感染過(guò)程中,外膜蛋白的抗原變異特征,本研究進(jìn)行了:1.羊無(wú)漿體持續(xù)感染綿羊模型的構(gòu)建。靜脈注射羊無(wú)漿體陽(yáng)性菌血(海北株),人工感染三只健康綿羊(編106~#、134~#、174~#)。接種后一年內(nèi),定期采血,經(jīng)涂片鏡檢、PCR檢測(cè)(靶標(biāo)msp4基因,869bp目的片段)和間接ELISA檢測(cè),成功構(gòu)建了羊無(wú)漿體持續(xù)感染綿羊模型。2.羊無(wú)漿體MSP1a蛋白的抗原變異分析。用artemis軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序的羊無(wú)漿體海北株全基因組進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)其msp1a基因存在末端重復(fù)。據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物AoMsp1a(F3/R3),以不同時(shí)間點(diǎn)全血DNA為模板(模型羊持續(xù)感染1年內(nèi),用間接ELISA檢測(cè)抗體水平,選擇在抗體曲線拐點(diǎn)處的基因組樣品),擴(kuò)增得到10個(gè)msp1a末端重復(fù)序列,長(zhǎng)度883bp,克隆至pGEM-T easy載體,轉(zhuǎn)化E.coli(DH5α),涂布培養(yǎng)、挑單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒測(cè)序。將10個(gè)msp1a序列翻譯后進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。所有msp1a基因序列同源性99%,末端重復(fù)氨基酸序列總長(zhǎng)度為197氨基酸,其結(jié)構(gòu)分為4個(gè)區(qū)段:3個(gè)完全一致的重復(fù)區(qū)段(55個(gè)氨基酸)和1個(gè)32氨基酸區(qū)段,且與原始感染菌株的蛋白序列一致。結(jié)論:在實(shí)驗(yàn)性持續(xù)感染模型綿羊中,羊無(wú)漿體MSP1a蛋白序列和結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。3.羊無(wú)漿體MSP2蛋白高變區(qū)(Hypervariable region,HVR)抗原變異分析。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序的羊無(wú)漿體海北株全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)msp2基因家族包含1條全長(zhǎng)表達(dá)序列及5條同源基因,所有同源基因均包含HVR序列。針對(duì)msp2表達(dá)序列HVR設(shè)計(jì)套式PCR引物lzn111(F/R)和lzn22(F/R),擴(kuò)增10個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)樣品的msp2高變區(qū),最終獲得長(zhǎng)度457bp的目的片段,克隆至pGEM-T easy質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli(JM109),涂布培養(yǎng)挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒測(cè)序。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品測(cè)序得到10-15條序列,共得到130條HVR序列。翻譯為氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),MSP2高變區(qū)包含2個(gè)高變微區(qū),由3個(gè)保守序列隔開。高變微區(qū)在持續(xù)感染過(guò)程中,通過(guò)msp2表達(dá)位點(diǎn)與同源假基因高變區(qū)編碼序列之間的基因重組產(chǎn)生抗原變異,并且序列多樣性不斷增加。結(jié)論:MSP2蛋白高變區(qū)編碼序列在羊無(wú)漿體持續(xù)感染過(guò)程發(fā)生持續(xù)序列變異。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S855
【圖文】：

018 屆碩士學(xué)位論文 羊無(wú)漿體持續(xù)感染綿羊模型的構(gòu)建15圖2.1 紅細(xì)胞內(nèi)的羊無(wú)漿體Fig.2.1 A. ovis in red blood cells2.2 試驗(yàn)綿羊羊無(wú)漿體 PCR 檢測(cè)結(jié)果圖2.2 羊無(wú)漿體PCR檢測(cè)電泳結(jié)果圖Fig.2.2 PCR detection of A. ovisM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 106,134,174:MSP4擴(kuò)增產(chǎn)物M：2000DLMarker； 106,134,174:PCR product of MSP4每次采血提取的各實(shí)驗(yàn)羊基因組樣品均進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果約為869bp（圖2.2）。2.3 試驗(yàn)綿羊持續(xù)感染過(guò)程的抗體動(dòng)態(tài)曲線對(duì)3只試驗(yàn)綿羊持續(xù)感染過(guò)程采集的所有血清樣品進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)的結(jié)果表明，感染后特異性抗體一般在6至13天之內(nèi)出現(xiàn)，3周之后抗體會(huì)達(dá)到一個(gè)高峰，隨后開始出現(xiàn)一定的動(dòng)態(tài)波動(dòng)（圖2.3）。對(duì)感染后的一年內(nèi)所采樣品進(jìn)行抗體動(dòng)態(tài)分析，得到不同試驗(yàn)羊持續(xù)感染過(guò)程的抗體動(dòng)態(tài)曲線[68]。

Fig.2.1 A. ovis in red blood cells2.2 試驗(yàn)綿羊羊無(wú)漿體 PCR 檢測(cè)結(jié)果圖2.2 羊無(wú)漿體PCR檢測(cè)電泳結(jié)果圖Fig.2.2 PCR detection of A. ovisM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 106,134,174:MSP4擴(kuò)增產(chǎn)物M：2000DLMarker； 106,134,174:PCR product of MSP4每次采血提取的各實(shí)驗(yàn)羊基因組樣品均進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果約為869bp（圖2.2）。2.3 試驗(yàn)綿羊持續(xù)感染過(guò)程的抗體動(dòng)態(tài)曲線對(duì)3只試驗(yàn)綿羊持續(xù)感染過(guò)程采集的所有血清樣品進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)的結(jié)果表明，感染后特異性抗體一般在6至13天之內(nèi)出現(xiàn)，3周之后抗體會(huì)達(dá)到一個(gè)高峰，隨后開始出現(xiàn)一定的動(dòng)態(tài)波動(dòng)（圖2.3）。對(duì)感染后的一年內(nèi)所采樣品進(jìn)行抗體動(dòng)態(tài)分析，得到不同試驗(yàn)羊持續(xù)感染過(guò)程的抗體動(dòng)態(tài)曲線[68]。

018 屆碩士學(xué)位論文 羊無(wú)漿體持續(xù)感染綿羊模型的構(gòu)建16圖2.3 實(shí)驗(yàn)綿羊抗體動(dòng)態(tài)曲線（106#、134#、174#）Fig. 2.3 Kinetics of anti-A. ovis antibody in 3 experimentally infected sheep (Nos 106,134,174)3 討論本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建羊無(wú)漿體持續(xù)感染動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究其持續(xù)感染過(guò)程中的抗原變異做物質(zhì)準(zhǔn)備與初步探索。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)羊感染過(guò)程中的血涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)，通常在兩周左右，羊紅細(xì)胞中無(wú)漿體的感染率上升到一定程度，才能在血涂片中發(fā)現(xiàn)感染于紅細(xì)胞內(nèi)的羊無(wú)漿體病原。在一個(gè)月后，血涂片鏡檢便很難再觀察到紅細(xì)胞內(nèi)的無(wú)漿體病原。PCR檢測(cè)方法敏感性更高，感染一周左右即可檢測(cè)到。并且在隨后的持續(xù)采集樣品中，PCR檢測(cè)結(jié)果均表現(xiàn)為陽(yáng)性。這與無(wú)漿體感染宿主后的病原學(xué)特征表現(xiàn)一致[78]。同時(shí)我們還使用了實(shí)驗(yàn)室建立的AAAP蛋白間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)持續(xù)采集的所有樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，在人工感染5至15天內(nèi)就可以觀察到抗體濃度的變化，各感?

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4 諸欣平,Ｇｅｏｒｇｅｓ�。樱睿铮酰睿铮�,Ｗｉｌｉａｍ�。剩幔颍颍幔溃樱铮洌螅颍椤。裕瑁幔椋簦瑁铮睿纾常Γ耍危澹椋欤拢颍铮鳎�;套式PCR擴(kuò)增特定MSP2基因片段在惡性瘧流行病學(xué)上的應(yīng)用研究[J];寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào);1996年03期

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本文編號(hào)：2776730