發(fā)布時間：2020-07-30 03:46

【摘要】：為了構建能穩(wěn)定表達豬白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)的細胞系,本研究對豬IL-4基因進行了克隆,發(fā)現該基因開放閱讀框(ORF)長402 bp,編碼133個氨基酸,分子質量為15.02 ku,PI為8.64。與牛、綿羊、馬、貓、狗和人的同源性分別為80.5%、76.7%、72.7%、72.9%、72.0%和69.2%,而與小鼠的同源性僅為41.5%。通過Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切后將p IL-4基因插入含EGFP標簽的p IRES2-EGFP載體中,構建出重組質粒p IRES2-EGFP-p IL-4。該重組質粒轉染豬腸上皮細胞(IPEC-J2)后,經G418陽性篩選,獲得穩(wěn)定表達豬IL-4的細胞系。p IRES2-EGFP-PIL-4重組質粒轉染IPEC-J2細胞后第24小時,熒光定量PCR結果表明,IL-4 m RNA的表達量較對照組及空載體組極顯著升高(P0.01),熒光顯微鏡下亦可見大量綠色熒光表達。該細胞系在連續(xù)傳代28次以后,仍可見IL-4在基因水平和蛋白水平的高表達。本研究成功構建了真核表達載體p IRES2-EGFP-p IL-4和能穩(wěn)定表達豬IL-4的細胞系,為進一步研究其功能奠定了基礎。
【圖文】：

第7期李俊敏等：豬IL-4穩(wěn)定表達細胞系的建立圖1pIRES2-EGFP-pIL-4重組質粒的鑒定Fig.1IdentificationofrecombinantplasmidpIRES2-EG-FP-pIL-41：重組質粒pIRES2-EGFP-pIL-4；2：質粒pIRES2-EGFP-pIL-4的EcoRⅠ+BamHⅠ雙酶切產物；M：DNA分子質量標準1：RecombinantplasmidpIRES2-EGFP-pIL-4；2：ProductsfrompIRES2-EGFP-pIL-4digestedbyEcoRⅠandBamHⅠ；M：DL5000DNAMark-erExTaq酶25L，ddH2O21L。PCR擴增條件：預變性94℃5min；變性94℃1min，退火溫度54℃30s，延伸72℃1min（34個循環(huán)）；延伸72℃5min；4℃保存。產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳后，GelDNAExtractionKit回收目的片段（具體操作參考說明書），經EcoRⅠ＋BamHⅠ雙酶切后，插入到載體pIRES2-EGFP中，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后涂布于含氨芐青霉素（100g/L）的LB瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)14h后，挑選白色單菌落接種于10LLB液體培養(yǎng)基中，取1L菌液進行PCR鑒定。陽性菌液接種于含有氨芐青霉素的10mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃，160r/min振蕩培養(yǎng)14h�？焖儋|粒小提試劑盒抽提質粒，送上海英濰捷基貿易有限公司測序。利用NCBI在線ORFFinder軟件查找豬IL-4基因的開放閱讀框，利用DNAstar軟件翻譯ORF核苷酸序列，用DNAman軟件中的多序列比對程序與GenBank上已發(fā)表的牛、綿羊、馬、貓、狗、人和小鼠IL-4的氨基酸序列進行同源性比較；通過ExpAsy的Prot-scale程序計算疏水性。1.5細胞培養(yǎng)用含10％胎牛血清（Gibco）的高糖DMEMF12（Gibco）將IPEC-J2細胞（ATCC）培養(yǎng)于37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中。細胞傳代時先用PBS清洗2～3次，再用0.25％的胰酶（Gibco）進行消化。1.6轉染及篩選按照脂質體Lip3000（Invitrogen）的說明書，將重組質粒轉入處于對數生長?

中國獸醫(yī)科學第47卷圖3陽性細胞集落400×Fig.3ThepositivecellscolonyA：空白對照；B：轉染pIRES2-EGFP-pIL-4重組質粒的細胞后第1天的熒光表達情況A：Blankcontrol；BIPEJ-C2cellstranfectedbypIRES2-EGFP-pIL-4after1dlater圖4轉染后細胞的生長曲線Fig.4Thegrowthcurveoftransfectedcells**表示差異極顯著（P＜0.01）。下同**thedifferencearehighlysignificant（P＜0.01）.Thesameasfollows圖2豬IL-4基因序列Fig.2SequencesofporcineIL-4gene下劃線部分為開放閱讀框TheunderlinesequenceshowedtheopenreadingframeofIL-4表2不同物種的IL-4氨基酸序列同源性比較Table2HomologycomparisonofIL-4aminoacidsequencesindifferentspecies達（見圖3）。且轉染IL-4基因后，細胞的生長狀態(tài)與對照組相比并未見明顯變化（見圖4）。說明該基因能在IPEC-J2中成功表達，且對細胞的生長沒有顯著影響。2.5陽性細胞篩選及鑒定用濃度為1mg/mL的G418結合有限稀釋法對轉染細胞進行連續(xù)篩選，每48h傳代一次，傳代20次和28次時分別在倒置熒光顯微鏡下觀察，均可見物種Species豬Pig黃牛Cattle綿羊Sheep馬Horse貓Cat犬Dog人Human小鼠Mice豬Pig100黃牛Cattle80.5100綿羊Sheep76.790.4100馬Horse72.767.463.6100貓Cat72.966.965.462.9100犬Dog72.065.963.661.182.6100人Human69.264.764.761.557.956.1100小鼠Mice41.541.538.541.741.541.940.7100％900

中國獸醫(yī)科學第47卷圖3陽性細胞集落400×Fig.3ThepositivecellscolonyA：空白對照；B：轉染pIRES2-EGFP-pIL-4重組質粒的細胞后第1天的熒光表達情況A：Blankcontrol；BIPEJ-C2cellstranfectedbypIRES2-EGFP-pIL-4after1dlater圖4轉染后細胞的生長曲線Fig.4Thegrowthcurveoftransfectedcells**表示差異極顯著（P＜0.01）。下同**thedifferencearehighlysignificant（P＜0.01）.Thesameasfollows圖2豬IL-4基因序列Fig.2SequencesofporcineIL-4gene下劃線部分為開放閱讀框TheunderlinesequenceshowedtheopenreadingframeofIL-4表2不同物種的IL-4氨基酸序列同源性比較Table2HomologycomparisonofIL-4aminoacidsequencesindifferentspecies達（見圖3）。且轉染IL-4基因后，細胞的生長狀態(tài)與對照組相比并未見明顯變化（見圖4）。說明該基因能在IPEC-J2中成功表達，且對細胞的生長沒有顯著影響。2.5陽性細胞篩選及鑒定用濃度為1mg/mL的G418結合有限稀釋法對轉染細胞進行連續(xù)篩選，每48h傳代一次，傳代20次和28次時分別在倒置熒光顯微鏡下觀察，均可見物種Species豬Pig黃牛Cattle綿羊Sheep馬Horse貓Cat犬Dog人Human小鼠Mice豬Pig100黃牛Cattle80.5100綿羊Sheep76.790.4100馬Horse72.767.463.6100貓Cat72.966.965.462.9100犬Dog72.065.963.661.182.6100人Human69.264.764.761.557.956.1100小鼠Mice41.541.538.541.741.541.940.7100％900

【參考文獻】

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本文編號：2774965