【摘要】：為了構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)豬白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)的細(xì)胞系,本研究對豬IL-4基因進(jìn)行了克隆,發(fā)現(xiàn)該基因開放閱讀框(ORF)長402 bp,編碼133個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為15.02 ku,PI為8.64。與牛、綿羊、馬、貓、狗和人的同源性分別為80.5%、76.7%、72.7%、72.9%、72.0%和69.2%,而與小鼠的同源性僅為41.5%。通過Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切后將p IL-4基因插入含EGFP標(biāo)簽的p IRES2-EGFP載體中,構(gòu)建出重組質(zhì)粒p IRES2-EGFP-p IL-4。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)后,經(jīng)G418陽性篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)豬IL-4的細(xì)胞系。p IRES2-EGFP-PIL-4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞后第24小時(shí),熒光定量PCR結(jié)果表明,IL-4 m RNA的表達(dá)量較對照組及空載體組極顯著升高(P0.01),熒光顯微鏡下亦可見大量綠色熒光表達(dá)。該細(xì)胞系在連續(xù)傳代28次以后,仍可見IL-4在基因水平和蛋白水平的高表達(dá)。本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體p IRES2-EGFP-p IL-4和能穩(wěn)定表達(dá)豬IL-4的細(xì)胞系,為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

第7期李俊敏等：豬IL-4穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立圖1pIRES2-EGFP-pIL-4重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1IdentificationofrecombinantplasmidpIRES2-EG-FP-pIL-41：重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-pIL-4；2：質(zhì)粒pIRES2-EGFP-pIL-4的EcoRⅠ+BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1：RecombinantplasmidpIRES2-EGFP-pIL-4；2：ProductsfrompIRES2-EGFP-pIL-4digestedbyEcoRⅠandBamHⅠ；M：DL5000DNAMark-erExTaq酶25L，ddH2O21L。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃5min；變性94℃1min，退火溫度54℃30s，延伸72℃1min（34個(gè)循環(huán)）；延伸72℃5min；4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，GelDNAExtractionKit回收目的片段（具體操作參考說明書），經(jīng)EcoRⅠ＋BamHⅠ雙酶切后，插入到載體pIRES2-EGFP中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布于含氨芐青霉素（100g/L）的LB瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)14h后，挑選白色單菌落接種于10LLB液體培養(yǎng)基中，取1L菌液進(jìn)行PCR鑒定。陽性菌液接種于含有氨芐青霉素的10mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃，160r/min振蕩培養(yǎng)14h�？焖儋|(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序。利用NCBI在線ORFFinder軟件查找豬IL-4基因的開放閱讀框，利用DNAstar軟件翻譯ORF核苷酸序列，用DNAman軟件中的多序列比對程序與GenBank上已發(fā)表的牛、綿羊、馬、貓、狗、人和小鼠IL-4的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較；通過ExpAsy的Prot-scale程序計(jì)算疏水性。1.5細(xì)胞培養(yǎng)用含10％胎牛血清（Gibco）的高糖DMEMF12（Gibco）將IPEC-J2細(xì)胞（ATCC）培養(yǎng)于37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞傳代時(shí)先用PBS清洗2～3次，再用0.25％的胰酶（Gibco）進(jìn)行消化。1.6轉(zhuǎn)染及篩選按照脂質(zhì)體Lip3000（Invitrogen）的說明書，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入處于對數(shù)生長?

中國獸醫(yī)科學(xué)第47卷圖3陽性細(xì)胞集落400×Fig.3ThepositivecellscolonyA：空白對照；B：轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-pIL-4重組質(zhì)粒的細(xì)胞后第1天的熒光表達(dá)情況A：Blankcontrol；BIPEJ-C2cellstranfectedbypIRES2-EGFP-pIL-4after1dlater圖4轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長曲線Fig.4Thegrowthcurveoftransfectedcells**表示差異極顯著（P＜0.01）。下同**thedifferencearehighlysignificant（P＜0.01）.Thesameasfollows圖2豬IL-4基因序列Fig.2SequencesofporcineIL-4gene下劃線部分為開放閱讀框TheunderlinesequenceshowedtheopenreadingframeofIL-4表2不同物種的IL-4氨基酸序列同源性比較Table2HomologycomparisonofIL-4aminoacidsequencesindifferentspecies達(dá)（見圖3）。且轉(zhuǎn)染IL-4基因后，細(xì)胞的生長狀態(tài)與對照組相比并未見明顯變化（見圖4）。說明該基因能在IPEC-J2中成功表達(dá)，且對細(xì)胞的生長沒有顯著影響。2.5陽性細(xì)胞篩選及鑒定用濃度為1mg/mL的G418結(jié)合有限稀釋法對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)篩選，每48h傳代一次，傳代20次和28次時(shí)分別在倒置熒光顯微鏡下觀察，均可見物種Species豬Pig黃牛Cattle綿羊Sheep馬Horse貓Cat犬Dog人Human小鼠Mice豬Pig100黃牛Cattle80.5100綿羊Sheep76.790.4100馬Horse72.767.463.6100貓Cat72.966.965.462.9100犬Dog72.065.963.661.182.6100人Human69.264.764.761.557.956.1100小鼠Mice41.541.538.541.741.541.940.7100％900

中國獸醫(yī)科學(xué)第47卷圖3陽性細(xì)胞集落400×Fig.3ThepositivecellscolonyA：空白對照；B：轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-pIL-4重組質(zhì)粒的細(xì)胞后第1天的熒光表達(dá)情況A：Blankcontrol；BIPEJ-C2cellstranfectedbypIRES2-EGFP-pIL-4after1dlater圖4轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長曲線Fig.4Thegrowthcurveoftransfectedcells**表示差異極顯著（P＜0.01）。下同**thedifferencearehighlysignificant（P＜0.01）.Thesameasfollows圖2豬IL-4基因序列Fig.2SequencesofporcineIL-4gene下劃線部分為開放閱讀框TheunderlinesequenceshowedtheopenreadingframeofIL-4表2不同物種的IL-4氨基酸序列同源性比較Table2HomologycomparisonofIL-4aminoacidsequencesindifferentspecies達(dá)（見圖3）。且轉(zhuǎn)染IL-4基因后，細(xì)胞的生長狀態(tài)與對照組相比并未見明顯變化（見圖4）。說明該基因能在IPEC-J2中成功表達(dá)，且對細(xì)胞的生長沒有顯著影響。2.5陽性細(xì)胞篩選及鑒定用濃度為1mg/mL的G418結(jié)合有限稀釋法對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)篩選，每48h傳代一次，傳代20次和28次時(shí)分別在倒置熒光顯微鏡下觀察，均可見物種Species豬Pig黃牛Cattle綿羊Sheep馬Horse貓Cat犬Dog人Human小鼠Mice豬Pig100黃牛Cattle80.5100綿羊Sheep76.790.4100馬Horse72.767.463.6100貓Cat72.966.965.462.9100犬Dog72.065.963.661.182.6100人Human69.264.764.761.557.956.1100小鼠Mice41.541.538.541.741.541.940.7100％900

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 代振江;周莉;曾智勇;湯德元;梁海英;劉釗;王偉丞;;貴州白香豬IL-2、IL-4和IL-6基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2015年05期

2 周翔;紀(jì)立凱;李振紅;王鵬;劉榜;;穩(wěn)定表達(dá)豬SARM1的MARC-145細(xì)胞系的建立[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2015年04期

3 于瑋;何平;陶瑩;李洋;李晶;吳濤;伍冀湘;戴潔;;DcR3-RNAi-SW480結(jié)腸癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型的建立及方法優(yōu)化[J];臨床薈萃;2012年22期

4 何延華;房永祥;陳國華;段風(fēng)云;王生富;李小慶;景志忠;;牦牛IL-4基因的克隆及其遺傳演化關(guān)系分析[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2008年08期

5 黃道超;楊光友;張志和;張安居;郭萬柱;王成東;候蓉;沈富軍;袁欣;;大熊貓IL-4基因的克隆與序列分析[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2008年05期

6 李軍,熊艷蕓,梁湘,廖素環(huán),羅廷榮;廣西巴馬小型豬IL-4和IL-10基因的克隆和序列分析[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2005年10期

7 楊秀芹,劉娣,韓玉剛;動物基因打靶技術(shù)的原理與應(yīng)用[J];國外畜牧科技;2001年05期

8 黃欣,趙忠良,曹雪濤;人白細(xì)胞介素4在大腸桿菌中的優(yōu)化表達(dá)[J];中國免疫學(xué)雜志;1999年09期

9 趙曉東，李成榮，楊錫強(qiáng)，蔣麗萍;人IL-4重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及在人腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1998年01期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 楊曉琮;穩(wěn)定表達(dá)人GM-CSF、IL-4的EA.hy926細(xì)胞株建立[D];青島大學(xué);2012年

2 廖艷;長毛兔白細(xì)胞介素-4（IL-4）基因克隆及真核表達(dá)[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

3 羅啟慧;豬IL-4和IL-6基因的克隆、表達(dá)及疫苗佐劑效應(yīng)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2005年

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李俊敏;蔡彬;雍艷紅;鞏棟梁;馮園;何玉林;巨向紅;;豬IL-4穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2017年07期

2 李俊敏;雍艷紅;鞏棟梁;馮園;韋璇;何玉林;巨向紅;;豬GM-CSF穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2017年05期

3 梁海英;曾智勇;王偉丞;湯德元;劉釗;;貴州白香豬白細(xì)胞介素4全基因的克隆與序列分析[J];豬業(yè)科學(xué);2014年12期

4 孫國貴;劉青;程云杰;胡萬寧;;細(xì)胞周期蛋白G2在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平與臨床意義[J];臨床薈萃;2014年08期

5 章億剛;阮利霞;;Ki-67和pAKT在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)[J];臨床薈萃;2014年02期

6 陳丹;劉娟;黃健;劉新穎;王冉;史洪娜;王維龍;沈林;李鼎鋒;;恒河猴白細(xì)胞介素-4基因的合成、原核表達(dá)及純化[J];中國生物制品學(xué)雜志;2011年09期

7 王羽騁;梁聰;貢成良;;轉(zhuǎn)基因家蠶的研究進(jìn)展[J];江蘇蠶業(yè);2011年02期

8 孫衛(wèi)國;李邦印;張靈霞;李國利;熊志紅;程小星;;pBV220/hIL-4優(yōu)化表達(dá)及其包涵體復(fù)性研究[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年05期

9 李軍;潘艷;yば郾

本文編號：2774965