發(fā)布時間：2020-07-30 02:40

【摘要】：乳房炎是奶牛常見病,無乳鏈球菌(Streptococus agalactiae)是奶牛乳房炎的重要病原體之一。除了在乳腺組織中定植,無乳鏈球菌還可通過黏附入侵奶牛乳腺上皮細胞(BMECs),宿主則會通過基因表達及程序性死亡來抵御細菌入侵。目前對于無乳鏈球菌黏附、入侵BMECs及宿主細胞抵御細菌入侵的機制尚不清楚。細胞焦亡(pyroptosis)是裂解性、炎性細胞死亡,主要由胞內(nèi)菌誘導,是近年發(fā)現(xiàn)的生物體對抗病原體感染的新機制。無乳鏈球菌是否可以誘導奶牛乳腺上皮細胞發(fā)生細胞焦亡尚未見報道。本研究通過酶消化法分離原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞(primary BMECs,pBMECs),并以此細胞為模型,探究無乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細胞的機制以及誘導細胞發(fā)生焦亡的情況。首先,本研究利用無乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細胞,通過激光共聚焦與胞內(nèi)菌落計數(shù)的方法來確定細菌入侵細胞;運用比較蛋白質(zhì)組學分析并篩選出無乳鏈球菌入侵相關的差異表達蛋白,再進行Western blot驗證;采用胞內(nèi)菌落計數(shù)法及qPCR檢測細菌特異性基因的方法,分別檢測乳腺上皮細胞在LAMB2轉(zhuǎn)錄后沉默或LAMB2抗體封閉,整合素(Integrin)抑制劑(RGD)預處理,ITGAV轉(zhuǎn)錄后沉默,FAK小分子抑制劑(TAE226)預處理或FAK轉(zhuǎn)錄后沉默,Crk轉(zhuǎn)錄后沉默或過表達,Vps25轉(zhuǎn)錄后沉默或過表達情況下,無乳鏈球菌入侵到細胞內(nèi)的細菌數(shù)目;采用Western blot檢測乳腺上皮細胞在整合素抑制劑(RGD)預處理,FAK小分子抑制劑(TAE226)預處理或FAK轉(zhuǎn)錄后沉默,Crk轉(zhuǎn)錄后沉默,Vps25轉(zhuǎn)錄后沉默情況下,無乳鏈球菌入侵誘導的FAK表達及其磷酸化水平,Crk表達及其磷酸化水平,Vps25和RhoA表達水平的變化。通過Western blot,ELISA,掃描電鏡等方法探究無乳鏈球菌誘導奶牛乳腺上皮細胞焦亡的情況。實驗結果表明:1)無乳鏈球菌在不同MOI下侵染pBMECs 2 h,可以入侵到細胞內(nèi);2)無乳鏈球菌以MOI為100侵染pBMECs 2 h,收集細胞,提取細胞總蛋白,做蛋白質(zhì)組檢測。通過比較蛋白質(zhì)組分析,與對照組相比,無乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細胞組共有169個差異表達蛋白,其中37個蛋白可以被GO及KEGG注釋,包含16個上調(diào)蛋白和21個下調(diào)蛋白;3)結合本文研究目的和內(nèi)容選擇Crk、Vps25及RhoA用Western blot進行驗證,結果與比較蛋白質(zhì)組學分析結果一致,無乳鏈球菌入侵導致Crk表達上調(diào),Vps25及RhoA的表達下調(diào);4)細胞外基質(zhì)蛋白laminin基因(LAMB2)轉(zhuǎn)錄后沉默或抗體封閉LAMB2,會顯著抑制無乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細胞的數(shù)目(p㩳0.05),預示LAMB2介導細菌入侵;5)特異性抑制劑RGD預處理細胞抑制Integrin活性,或ITGAV轉(zhuǎn)錄后沉默減少Integrin表達,顯著抑制無乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細胞的數(shù)目(p㩳0.05),預示Integrin介導細菌入侵;6)FAK特異性抑制劑TAE226預處理細胞抑制FAK活性,或FAK轉(zhuǎn)錄后沉默減少FAK表達,顯著減少無乳鏈球菌入侵到乳腺上皮細胞的數(shù)目(p㩳0.05),預示FAK介導細菌入侵;7)Crk轉(zhuǎn)錄后沉默顯著提高無乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細胞的數(shù)目(p㩳0.05),反之Crk過表達則顯著減少無乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細胞的數(shù)目(p㩳0.05),預示Crk具有抵御細菌入侵的作用;8)Vps25轉(zhuǎn)錄后沉默顯著提高無乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細胞的數(shù)目(p㩳0.05),反之Vps25過表達則顯著減少無乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細胞的數(shù)目(p㩳0.01),預示Vps25具有抵御細菌入侵的作用;9)無乳鏈球菌入侵促進FAK磷酸化,抑制Crk磷酸化,抑制Vps25和RhoA表達,預示細菌通過激活FAK抑制Crk活性,進而抑制Vps25表達,減弱細胞抵御細菌入侵的能力。同時細菌入侵抑制了RhoA表達,預示可以促進細胞骨架重排,有利于細菌內(nèi)化;10)Co-IP結果初步證明Crk與Vps25之間存在相互作用,二者可能協(xié)同抵御細菌入侵;11)無乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細胞24 h后,Caspas-1被激活,IL-1β及IL-18的分泌增加,細胞膜上形成小孔,表明無乳鏈球菌通過經(jīng)典途徑誘導奶牛乳腺上皮細胞發(fā)生焦亡。總之,無乳鏈球菌入侵乳腺上皮細胞,通過與細胞外基質(zhì)laminin(LAMB2)結合實現(xiàn)黏附,通過整合素Integrin實現(xiàn)內(nèi)化。細菌入侵激活FAK,抑制Crk活性和Vps25表達,同時使得RhoA表達降低,引起細胞骨架重排,細菌進入到細胞內(nèi)。在此過程中Crk與Vps25起到協(xié)同抵抗細菌入侵的作用,FAK的激活則有利于細菌入侵。無乳鏈球菌入侵誘導奶牛乳腺上皮細胞通過經(jīng)典途徑發(fā)生焦亡,以抵抗病原菌感染。實驗所得數(shù)據(jù)為奶牛乳房炎的預防和治療提供了科學依據(jù)和理論基礎。
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23
【圖文】：

無乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細胞的機制研究Caspase-4/5/11介導的非經(jīng)典途徑。在經(jīng)典途徑中，病原體或者其相關毒力因子激活各自的性小體，包括NLRP1b、NLRP3、NLRC4、AIM2或Pyrin。NLRP3和NLRC4炎癥體的激活需激酶NEK7和NAIP3的配合[111-113]。炎癥小體傳感器觸發(fā)炎癥小體轉(zhuǎn)接器ASC招募Caspase-體，激活Caspase-1，使得Gasdermin D和pro- IL-1β、pro-IL-18被切割，而31kDa的Gasdermi的N端被切割后在細胞膜上打孔形成孔洞，使得胞內(nèi)的內(nèi)容物釋放，同時也將IL-1β和IL-1放到細胞外[114-121]。對于非經(jīng)典途徑，它是由來自胞內(nèi)的分離自革蘭氏陰性菌的LPS引起的在人的細胞中激活Caspase-4或者Caspase-5，在小鼠細胞中激活Caspase-11。這些被激活Cspase直接裂解Gasdermin D引起細胞焦亡。同時Gasdermin D裂解的N端也可以去激活NL這個炎性小體，進而激活Caspase-1釋放IL-1β和IL-18[122-125]。目前這兩條途徑及其涉及到的性小體和Gasdermin家族是細胞焦亡的研究熱點。

圖2.1 iTRAQ四標實驗技術路線g.2.1 iTRAQ four standard experimental technology roS-PAGE電泳檢測，F(xiàn)ASP酶解，LC-MS質(zhì)譜分白質(zhì)鑒定數(shù)量；并通過以下步驟：肽段iTR樣品間蛋白質(zhì)的相對含量。和篩選行數(shù)據(jù)分析，RAW文件通過Proteome Disc 好 的 數(shù) 據(jù) 庫 ， 再 利 用 軟 件 Masc6_20150414.fasta進行查庫鑒定。采用Proteom強度值進行定量分析。是選擇含量差異2倍以上的作為差異蛋白， Cluster軟件對蛋白質(zhì)功能進行注釋，基于

內(nèi)蒙古大學博士學位論文36圖2.2 激光掃描共聚焦觀察S. agalactiae入侵pBMECs（200×）激光掃描共聚焦顯微鏡觀察S. agalactiae入侵pBMECs 2 h，MOI為100:1和未入侵，Alexa Fluor 594Phalloidin 鬼筆環(huán)肽染色肌動蛋白(Actin)呈紅色；DAPI染色細胞核呈藍色；CFDA染色S. agalactiae呈綠色；Marged為疊加后圖像。Fig. 2.2 S. agalactiae invaded pBMECs by LSCM（200×）pBMECs were either uninvaded or invaded with S. agalactiae at MOI of 100 for 2 h，Alexa Fluor 594 Phalloidinstaining actin, red; DAPI staining nuclei, blue; CFDA staining S. agalactiae, green; Marged is a superimposedimage.3.2 無乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細胞的蛋白質(zhì)組學分析與驗證3.2.1 蛋白質(zhì)組學樣品的制備與分析由于比較蛋白質(zhì)組學檢測的要求，為了符合檢測的標準，保證數(shù)據(jù)的全面性與準確性。因此本實驗設置兩組，正常pBMECs組（control），及S. agalactiae 以MOI為100:1入條件侵pBMECs 2 h，再用含有溶菌酶和抗生素的培養(yǎng)基細胞外殺菌2 h組。為了保證蛋白質(zhì)組檢測要求以及生物學重復要求

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