【摘要】：雞的心包積液綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)和包涵體肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)均是由禽Ⅰ群腺病毒引起的急性傳染病。近年來,這兩種疾病在我國的發(fā)病率呈上升趨勢,給養(yǎng)雞業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失。禽Ⅰ群腺病毒分為A、B、C、D、E等5個基因型,按照血清型分為1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11型;基因型和血清型的對應(yīng)關(guān)系為A(1)、B(5)、C(4、10)、D(2、3、9、11)、E(6、7、8a、8b)。當(dāng)前我國HHS和IBH的主要病原分別是禽Ⅰ群腺病毒血清4型(FAdV-4)和血清8b型(FAdV-8b)。因此,研制FAdV-4和FAdV-8b二價油乳劑滅活疫苗具有重要的應(yīng)用價值。1 FAdV-8b QD2016株的分離與鑒定本研究從山東某雞場疑似發(fā)生IBH的病例中分離到1株禽腺病毒(命名為QD2016株)。設(shè)計了 33對引物,對QD2016株全基因組序列進行擴增、測定和生物信息學(xué)分析。(QD2016株基因組全長為43632bp,與禽Ⅰ群腺病毒E基因型CR119株、YR36株、TR59株、764株、HG株、UPM04217株、HLJ/151129株同屬一個大的進化分支,核苷酸序列同源性介于93.4%～98.4%之間;QD2016株與UPM04217株親緣關(guān)系最近,同屬于FAdV-8b。2 FAdV-4和FAdV-8b二價油乳劑滅活疫苗的研制本研究以FAdV-8b QD2016株和實驗室先前分離鑒定的FAdV-4 GX2013株研制二價油乳劑滅活疫苗。根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》的要求建立了兩個毒株的種子庫,經(jīng)檢驗無禽白血病病毒(ALV)和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)等外源病毒的污染。利用細胞工廠培養(yǎng)LMH細胞,用于擴增FAdV-4 GX2013株和FAdV-8b QD2016株。應(yīng)用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR的方法,對擴增的病毒進行定量分析;確定擴增GX2013株和QD2016株的最佳感染復(fù)數(shù)分別為1.2和3.2,適宜的收毒時間均為接毒后72 h。病毒液經(jīng)終濃度為1‰的甲醛滅活,以白油為佐劑制成油乳劑滅活疫苗。研制的疫苗為油包水劑型,物理性狀穩(wěn)定,無菌檢驗合格。取7日齡SPF雞20只,分為2組,每組10只。第1組為免疫組,于頸部皮下接種制備的滅活疫苗,0.5mL/只;第2組為對照組,于頸部皮下接種等劑量的滅菌白油。接種后21 d內(nèi)免疫組和對照組的雞精神狀況及采食量均正常,剖檢未發(fā)現(xiàn)接種部位出現(xiàn)損傷、炎癥及疫苗殘留等現(xiàn)象,表明該疫苗的安全性良好。將7日齡SPF雞分成6組,每組10只,分別免疫25 μL、50μL、100μL、250 μL和500μL疫苗,以及500μL滅菌白油(對照組)。免疫后21 d,每組各取5只雞,分別用FAdV-4GX2013 株(105.5 TCID50/mL)和 FAdV-8bQD2016 株(105.5TCID50/mL)經(jīng)肌肉注射進行攻毒,0.2 mL/只;分別于攻毒后3 d、5 d、7 d和10 d采集試驗雞的咽喉拭子和泄殖腔拭子,應(yīng)用SYBR Green I實時熒光定量PCR的方法測定病毒含量。結(jié)果顯示,攻毒后7 d內(nèi)咽喉和泄殖腔排毒量相繼達到高峰,其中25μL、50 μL和100μL免疫組的排毒量與對照組相比差異不顯著(P0.5),250 μL和500 μL免疫組的排毒量與對照組相比差異極顯著(P0.01),而這兩個免疫組之間的排毒量差異不顯著(P0.5)。據(jù)此推測:疫苗的免疫劑量為250 μL和500 μL/只均能有效阻止排毒,建議的疫苗免疫劑量為250 μpL/只。取7日齡SPF雞30只,分為3組,每組10只。第1組和第2組為免疫組,每只雞頸部皮下接種250 μL疫苗;第3組為對照組,每只雞頸部皮下接種250 μL滅菌白油。第1組的雞只于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d和35 d采血分離血清,分別應(yīng)用血清中和試驗(SNT)和瓊脂擴散試驗(AGPT)監(jiān)測抗體消長規(guī)律。第2組和第3組的雞只于免疫后21 d 各取 5 只,分別用 FAdV-4 GX2013 株(106.5 TCID50/mL)和 FAdV-8b QD2016 株(106.5 TCID50/mL)經(jīng)肌肉注射進行攻毒,0.2mL/只;分別于攻毒后3d、5d、7d和10d采集試驗雞的咽喉拭子和泄殖腔拭子,應(yīng)用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR的方法測定病毒含量。SNT結(jié)果顯示,在免疫后7d可檢測到FAdV-4和FAdV-8b血清中和抗體,免疫后21 d均達到峰值(210.7和210.6),以后逐漸下降,到免疫后35 d仍能保持較高水平(210.2和29.9);AGPT結(jié)果顯示,在免疫后14d可檢測到FAdV-4和FAdV-8b抗體,21d抗體陽性率最高(100%和90%),隨后開始緩慢下降,AGPT抗體增長規(guī)律與血清中和抗體保持一致。攻毒保護試驗結(jié)果顯示,對照組的雞只在攻FAdV-4GX2013株后3d內(nèi)全部死亡,免疫組的雞只表現(xiàn)正常,臨床保護率達100%;對照組的雞只在攻FAdV-8bQD2016株后出現(xiàn)采食量下降、精神沉郁、拉稀等現(xiàn)象,免疫組的雞只表現(xiàn)正常,免疫組和對照組雞只的咽喉拭子和泄殖腔拭子中病毒含量差異極顯著(P0.01)。綜上所述,研制的二價油乳劑滅活疫苗具有良好的免疫保護效果。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4
【圖文】：

逡逑喔＿逡逑圖１．１邋ＬＭＨ細胞在不同時間的細胞病變逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅｓ逡逑２．２間接免疫熒光（ＩＦＡ）檢測逡逑利用本實驗室保存的雞抗ＦＡｄＶ－８ｂ陽性血清，對ＱＤ２０１６株利用間接免疫熒光進行鑒逡逑定。如圖所示，接種ＱＤ２０１６株的ＬＭＨ細胞可見有明顯的綠色熒光（圖１．２Ａ），而未接逡逑種ＱＤ２０１６株的ＬＭＨ細胞檢測不到熒光（圖１．２邋Ｂ）。表明ＱＤ２０１６株屬于ＦＡｄＶ－８ｂ且能逡逑在雞肝癌細胞系（ＬＭＨ）上很好的增殖。邐逡逑圖１．２間接免疫熒光檢測結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋．２邋Ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｉｎｄｉｒｅｃｔ邋ｉｍｍｕｎｏｆ

逑利用設(shè)計合成的３３對引物，對ＱＤ２０１６株全基因組進行ＰＣＲ分片段擴增。擴增結(jié)果逡逑顯示各片段與預(yù)期的目的條帶大小一致（如圖１．３、圖１．４）。將各片段分別克隆測序后經(jīng)拼逡逑接獲得了邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株的全基因組序列。逡逑Ｍｌ邋２邋３邋４邋５邋６邋７邋８邋９邋１０邋１１邋１２邋１３邋１４邋１５邋１６邋１７逡逑｜：‘：賀逡逑ＡＢＢＢ逡逑圖１．３ＰＣＲ分段擴增全基因電泳圖（１￣１７）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１？１７）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１？１７分別為前１７對引物擴增片段逡逑ｉｍ逡逑圖１．４邋ＰＣＲ分段擴增全基因電泳圖（１８？３３）逡逑Ｆｉｇ．邋１．４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１８－３３）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１８？３３：分別為后１６對引物擴增片段逡逑２．４邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株全基因組序列的分析逡逑２．４．１邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株基因組的分析逡逑用ＤＮＡＳｔａｒ軟件包對獲得的ＱＤ２０１６株全基因組序列進行系統(tǒng)分析，結(jié)果表明：逡逑ＱＤ２０１６邋株全長邋４３６３２邋ｂｐ，Ｇ＋Ｃ邋含量為邋５７．８％。參照邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＵＰＭ０４２１７邋株對其邋ＯＲＦ邋的位逡逑置以及編碼的蛋白進行了預(yù)測（見表１．２）

逑利用設(shè)計合成的３３對引物，對ＱＤ２０１６株全基因組進行ＰＣＲ分片段擴增。擴增結(jié)果逡逑顯示各片段與預(yù)期的目的條帶大小一致（如圖１．３、圖１．４）。將各片段分別克隆測序后經(jīng)拼逡逑接獲得了邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株的全基因組序列。逡逑Ｍｌ邋２邋３邋４邋５邋６邋７邋８邋９邋１０邋１１邋１２邋１３邋１４邋１５邋１６邋１７逡逑｜：‘：賀逡逑ＡＢＢＢ逡逑圖１．３ＰＣＲ分段擴增全基因電泳圖（１￣１７）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１？１７）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１？１７分別為前１７對引物擴增片段逡逑ｉｍ逡逑圖１．４邋ＰＣＲ分段擴增全基因電泳圖（１８？３３）逡逑Ｆｉｇ．邋１．４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１８－３３）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１８？３３：分別為后１６對引物擴增片段逡逑２．４邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株全基因組序列的分析逡逑２．４．１邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株基因組的分析逡逑用ＤＮＡＳｔａｒ軟件包對獲得的ＱＤ２０１６株全基因組序列進行系統(tǒng)分析，結(jié)果表明：逡逑ＱＤ２０１６邋株全長邋４３６３２邋ｂｐ，Ｇ＋Ｃ邋含量為邋５７．８％。參照邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＵＰＭ０４２１７邋株對其邋ＯＲＦ邋的位逡逑置以及編碼的蛋白進行了預(yù)測（見表１．２）

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