【摘要】：滑液支原體(Mycoplasma synoviae,MS)屬于柔膜體綱支原體屬,主要感染雞和火雞,能導致家禽關節(jié)腫大、滑液囊及腱鞘發(fā)炎和實質器官的腫大,在國內外感染嚴重。目前普遍認為MS感染機體后,能以各種方式黏附于宿主上皮細胞。許多支原體中與代謝相關的酶類已經被發(fā)現(xiàn)不僅分布于細胞質中發(fā)揮生物催化功能,同時分布于細胞膜表面,參與黏附宿主細胞,發(fā)揮致病作用。二氫硫辛酸脫氫酶(Dihydrolipoamidedehydrogenase,DLD)是一種黃素蛋白氧化還原酶,目前關于MS的DLD的相關研究很少,在本實驗中對MS的DLD的生物學功能及其黏附特性進行了研究,為進一步探索MS的致病機理提供了分子基礎。1.滑液支原體DLD的原核表達及蛋白純化參照NCBI中GenBank的MS WVU1853菌株的dld基因堿基序列,設計特異性引物,經Overlap PCR對基因進行點突變后,將獲得的突變后序列克隆至平末端載體pLB,經測序驗證成功后連接表達載體pET-28a(+),IPTG誘導表達后原核表達顯示重組MSDLD(rMSDLD)表達在上清,用His-tag蛋白純化磁珠對表達在上清中的rMSDLD進行純化,得到純化的rMSDLD蛋白。2.滑液支原體DLD的酶促動力學反應的測定因二氫硫辛酸脫氫酶是一種代謝酶,能將硫辛酰胺催化生成二氫硫辛酰胺,NADH失去H+生成NAD+,用酶標儀連續(xù)監(jiān)測底物NADH的量來顯示rMSDLD的酶促活性。結果顯示DLD具有一定的酶活性,其比活力為3.6 U/mg,最適pH為7.0、最適反應溫度為250C,雙倒數(shù)作圖法求出其公式為y=4.55x+0.1956(R2=0.9973),并求得rMSDLD的米氏常數(shù)Km(NADH)為23.2 μmol/L,最大反應速率Vmax為5.1 μmol/(L·min)。3.滑液支原體DLD的免疫原性、亞細胞定位檢測利用MS雞陽性血清作為一抗進行Western-blot檢測該蛋白的免疫原性。利用rMSDLD蛋白制備鼠多克隆抗體和兔多克隆抗體,并用ELISA法檢測其效價。然后用試劑盒提取MS膜蛋白和胞漿蛋白,利用制備的抗rMSDLD鼠血清作為一抗進行Western-blot反應檢測其亞細胞定位情況,同時進行懸浮免疫熒光實驗來確證rMSDLD蛋白是否分布于MS膜表面。接下來進行動物實驗,對蛋白的免疫保護性進行了評價,同時進行血清介導的補體殺菌實驗。免疫原性檢測結果發(fā)現(xiàn)雞陽性血清能夠別到0.1μg的rMSDLD蛋白,并且條帶的亮度與蛋白使用劑量呈正相關,證明蛋白具有較好的免疫原性。制備的鼠多克隆抗體、兔多克隆抗體利用ELISA法檢測到其血清效價達到2048000、1024000。用制備的鼠抗rMSDLD血清檢測該蛋白在MS中的亞細胞定位情況,發(fā)現(xiàn)該蛋白主要存在于MS的胞漿蛋白中,少量分布于MS膜組分中;懸浮免疫熒光證實該蛋白存在于MS膜表面。然后制備rMSDLD蛋白疫苗免疫SPF雞,MS攻毒后發(fā)現(xiàn)rMSDLD蛋白免疫能顯著降低雞只發(fā)病程度,具有一定的免疫保護力�？箁MSDLD血清介導的補體殺菌效力達到88.50%,與支原體結合后能夠有效激活補體,進而表現(xiàn)出良好的殺菌效果。4.滑液支原體DLD的粘附特性研究利用間接免疫熒光和ELISA實驗檢測rMSDLD與雞成纖維細胞DF-1的黏附反應,同時檢測抗rMSDLD兔血清對其黏附的抑制作用,結果發(fā)現(xiàn)rMSDLD能特異性的黏附到DF-1細胞上,且黏附能被抗rMSDLD兔血清顯著性抑制。然后利用Western-blot法和ELISA法檢測該蛋白與胞外基質蛋白雞纖溶酶原(Chickenplasminogen,cPlg)的黏附反應,結果發(fā)現(xiàn)rMSDLD蛋白與胞外基質蛋白cPlg黏附明顯。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.62
【圖文】：

通過ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫找到ＭＳｔ／Ｗ基因堿基序列，然后通過ＳｉｇｎａｌＰ４．１邋Ｓｅｒｖｅｒ預測出逡逑基因中無信號肽片段，Ｐｒｉｍｅｄ．Ｏ軟件分析該序列中含有四個堿基需要突變，因此利用該軟逡逑件設計５對特異性引物，經過ＰＣＲ擴增，獲得４個ＭＳ觀基因分片段（圖１．２），再用Ｏｖｅｒｌａｐ逡逑ＰＣＲ的方法將ＴＧＡ突變?yōu)椋裕牵谦@得基因全長（圖１．３），將ＰＣＲ擴增產物進行瓊脂逡逑糖凝膠電泳，并進行膠回收。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１２邐３邐４逡逑－１逡逑１０００邋＾——？邋１００７邋ｂｐ逡逑７５０逡逑５００邋＾￣￣？邋５８４邋ｂｐ逡逑２５０邋＾邐？邐１邋ｂｐ逡逑１００邐邋？邐１４４邋ｈｐ逡逑圖１．２邋ＭＳｏＷ基因的ＰＣＲ分段產物逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆＭＳｄｌｄ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ：邋２０００ＤＮＡ邋分子質量標準；１：邋ＭＳｃ／ＷｌＦ／ｌＲ邋擴增產物；２：邋ＭＳｏＷ２Ｆ／２Ｒ邋擴增產物；３：邋ＭＳｃ／Ｗ３Ｆ／３Ｒ逡逑擴X棽錚唬矗哄澹停櫻潁媯祝矗疲矗依┰霾錚誨義希停哄澹模蹋玻埃埃板澹模危鈴澹停幔潁耄澹潁誨澹保哄澹校茫義澹穡潁錚洌酰悖翦澹鰨椋簦楨澹穡潁椋恚澹潁簀澹錚媯停櫻洌

本文編號：2772836