【摘要】：嗜神經(jīng)病毒是一類(lèi)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)高度敏感的病毒,多種嗜神經(jīng)病毒具有嚴(yán)格的神經(jīng)嗜性,并且在感染后能夠沿特定方向跨突觸傳播。隨著基因工程和反向遺傳學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,嗜神經(jīng)病毒被改造為多種形式的環(huán)路標(biāo)記工具,用以解析中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)環(huán)路連接網(wǎng)絡(luò)。而且可結(jié)合鈣離子指示蛋白、光遺傳和化學(xué)遺傳工具特異性地監(jiān)測(cè)和操縱神經(jīng)環(huán)路的活性,對(duì)神經(jīng)環(huán)路的功能進(jìn)行研究。嗜神經(jīng)病毒在神經(jīng)元內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)方向具有一定的偏好性。單純皰疹病毒(HSV)的HSV129毒株和水泡性口炎病毒(VSV)主要以順行方向轉(zhuǎn)運(yùn),被作為神經(jīng)環(huán)路順向標(biāo)記工具�？袢《�(RABV),犬腺病毒2型(CAV),偽狂犬病毒(PRV)的bartha株和逆行標(biāo)記的腺相關(guān)病毒rAAV2-retro沿軸突逆行轉(zhuǎn)運(yùn),被改造用于神經(jīng)環(huán)路的逆向標(biāo)記。根據(jù)病毒的復(fù)制能力分為不跨突觸的標(biāo)記病毒和跨多級(jí)突觸的標(biāo)記病毒。不跨突觸的標(biāo)記病毒為復(fù)制缺陷型病毒,如G蛋白缺失的狂犬病毒(RABV-SAD-?G),E1蛋白缺失的犬腺病毒(CAV2)和rAAV2-retro,用以標(biāo)記注射位點(diǎn)的一級(jí)環(huán)路連接�？缍嗉�(jí)突觸的標(biāo)記病毒為復(fù)制完整型病毒,包括PRV的bartha株、RABV的固定毒株、HSV的H129毒株,隨著病毒的復(fù)制,可跨突觸標(biāo)記核團(tuán)的多級(jí)環(huán)路。如此繁多的病毒標(biāo)記工具,使科研工作者能夠更全面的解析大腦的神經(jīng)連接以及信號(hào)傳遞模式。在不同的研究中該如何準(zhǔn)確的選擇有效的病毒工具,依賴于我們對(duì)不同病毒特性的了解。不同來(lái)源的標(biāo)記病毒具有不同特性,包括病毒結(jié)構(gòu)、基因組、受體蛋白、復(fù)制包裝等過(guò)程,病毒只能夠入侵表達(dá)對(duì)應(yīng)受體蛋白的神經(jīng)元,進(jìn)入神經(jīng)元后通過(guò)與宿主蛋白的相互作用,完成病毒的復(fù)制、包裝等過(guò)程。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由種類(lèi)繁多的神經(jīng)元構(gòu)成,不同類(lèi)型的神經(jīng)元的基因表達(dá)各不相同。以上病毒與宿主之間的差異可能會(huì)導(dǎo)致嗜神經(jīng)病毒對(duì)不同類(lèi)群的神經(jīng)元具有不同的神經(jīng)嗜性,造成神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記的不一致。然而,目前對(duì)不同示蹤病毒的神經(jīng)嗜性比較,及其在環(huán)路標(biāo)記的影響并沒(méi)有系統(tǒng)的研究報(bào)道。本課題對(duì)目前常用的跨多級(jí)示蹤病毒和不跨突觸的示蹤的病毒的神經(jīng)嗜性和毒性進(jìn)行系統(tǒng)的分析比較,為神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記工具的合理應(yīng)用提供參考。1.多級(jí)逆行示蹤病毒神經(jīng)嗜性比較將表達(dá)綠色熒光蛋白的RABV的固定毒來(lái)源的CVS-B2c-EGFP和PRV Bartha株來(lái)源的PRV-152(EGFP)分別注射在小鼠的乆淋巴結(jié)。病毒粒子被支配淋巴結(jié)的神經(jīng)末吸收后沿神經(jīng)纖維逆行標(biāo)記支配淋巴結(jié)的神經(jīng)元,隨著病毒的復(fù)制和跨突觸感染,大腦內(nèi)的高級(jí)神經(jīng)連接網(wǎng)絡(luò)被標(biāo)記。通過(guò)全腦切片成像,對(duì)兩種病毒標(biāo)記的神經(jīng)元的核團(tuán)位置和數(shù)量進(jìn)行分析比較,結(jié)果顯示通過(guò)以上兩種逆向標(biāo)記病毒繪制的神經(jīng)環(huán)路存在差異。2.單級(jí)逆行示蹤病毒神經(jīng)嗜性比較將幾種常用的復(fù)制缺陷型病毒SAD-?G、rAAV2-retro、CAV2-Cre以及一種化學(xué)示蹤劑green retrobeads分別注射在鼠腦的相同核團(tuán),標(biāo)記注射位點(diǎn)的一級(jí)輸入環(huán)路。通過(guò)全腦切片、成像,對(duì)不同病毒標(biāo)記的神經(jīng)元的核團(tuán)和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同病毒標(biāo)記的神經(jīng)環(huán)路并不完全一致。進(jìn)一步通過(guò)Cre/Lox重組酶系統(tǒng)放大熒光蛋白信號(hào)排除不同病毒熒光蛋白表達(dá)差異;通過(guò)混合注射,排除注射誤差后,依然能夠觀察到標(biāo)記差異。這說(shuō)明不同的標(biāo)記病毒對(duì)大腦內(nèi)的神經(jīng)元類(lèi)群存在嗜性偏好。在對(duì)下丘腦的環(huán)路進(jìn)行標(biāo)記時(shí),rAAV2-retro更傾向于標(biāo)記皮層,而SAD-?G傾向于標(biāo)記下丘腦和基底神經(jīng)節(jié)。3.病毒神經(jīng)嗜性差異機(jī)制的初步探索病毒利用細(xì)胞膜上的受體感染進(jìn)入神經(jīng)元,不同類(lèi)型的病毒只識(shí)別并結(jié)合其對(duì)應(yīng)的特異受體蛋白。而且大腦內(nèi)的神經(jīng)元種類(lèi)繁多、功能各異,基因表達(dá)必定存在差異。因此,我們推測(cè)病毒具有神經(jīng)嗜性差異的重要因素是神經(jīng)元軸突末梢的病毒受體表達(dá)不均一,從而造成病毒對(duì)不同類(lèi)群的神經(jīng)元具有選擇性。我們?cè)赗ABV不敏感的神經(jīng)元過(guò)表達(dá)禽白血病病毒受體(TVA)后,能夠明顯提高對(duì)應(yīng)配體EnvA(禽白血病病毒囊膜蛋白)假包裝的狂犬病毒的感染性。這說(shuō)明神經(jīng)元表達(dá)對(duì)應(yīng)病毒受體后,能夠提高該病毒的神經(jīng)嗜性。為了進(jìn)一步探索決定神經(jīng)嗜性的分子機(jī)制,我們建立了鼠腦神經(jīng)元的單細(xì)胞分離方法,分離SAD-?G和rAAV2-retro標(biāo)記的神經(jīng)元,并進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。對(duì)22群SAD-?G標(biāo)記的神經(jīng)元和21群rAAV2-retro標(biāo)記的神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,推測(cè)造成兩種病毒神經(jīng)嗜性差異的分子機(jī)制。4.示蹤病毒的毒性比較示蹤病毒注射后由于病毒的感染和基因的表達(dá)勢(shì)必會(huì)對(duì)腦組織產(chǎn)生一定的毒性。我們首先通過(guò)組織RNA-seq對(duì)注射位點(diǎn)和逆標(biāo)記位點(diǎn)組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,分析病毒標(biāo)記對(duì)腦組織基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示病毒標(biāo)記誘導(dǎo)大量免疫相關(guān)基因的表達(dá),SAD-?G對(duì)注射位點(diǎn)和逆標(biāo)記位點(diǎn)的基因表達(dá)的改變比rAAV2-retro更顯著。進(jìn)而通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察到SAD-?G標(biāo)記后在注射位點(diǎn)和逆標(biāo)記位點(diǎn)出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的大量激活,rAAV2-retro僅在注射位點(diǎn)引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,而在逆標(biāo)記位點(diǎn)并未出現(xiàn)明顯的激活現(xiàn)象。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)SAD-?G逆標(biāo)記會(huì)引起催產(chǎn)素基因的高表達(dá)。5.多種示蹤病毒聯(lián)合應(yīng)用標(biāo)記高級(jí)神經(jīng)環(huán)路通過(guò)以上研究我們發(fā)現(xiàn),不同來(lái)源的示蹤病毒的神經(jīng)嗜性存在差異。我們利用病毒的神經(jīng)嗜性差異,對(duì)多種單級(jí)示蹤病毒聯(lián)合應(yīng)用,提出解析特定核團(tuán)的二級(jí)輸入環(huán)路策略。本研究通過(guò)比較不同嗜神經(jīng)病毒對(duì)大腦內(nèi)神經(jīng)元的感染特性,確定嗜神經(jīng)病毒對(duì)大腦內(nèi)的神經(jīng)元存在嗜性差異,并且通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序分析造成病毒神經(jīng)嗜性差異的分子機(jī)制。同時(shí)比較了不同嗜神經(jīng)病毒改造的神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記工具在腦組織內(nèi)產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。以上研究為嗜神經(jīng)病毒感染機(jī)制研究提供新的思路,同時(shí)也為嗜神經(jīng)病毒在神經(jīng)環(huán)路中的正確應(yīng)用提供參考。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【圖文】：

嗜神經(jīng)病毒神經(jīng)嗜性和毒性比較毒能夠隨著病毒的復(fù)制跨突觸感染多級(jí)神經(jīng)元(Card and Enquist, 2001; Tang999)。以上優(yōu)勢(shì)使嗜神經(jīng)病毒成為環(huán)路標(biāo)記中的新生力量。隨著基因工程技毒反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展，可對(duì)嗜神經(jīng)病毒的核酸序列進(jìn)行人工編輯，改的特性，包括對(duì)病毒轉(zhuǎn)運(yùn)方向和跨突觸能力的控制。還可以在病毒基因組插蛋白等標(biāo)記基因，結(jié)合熒光顯微鏡的使用，避免了免疫組織化學(xué)顯色的繁瑣golini, 2010)。攜帶多種功能蛋白的嗜神經(jīng)病毒可實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)環(huán)路功能的實(shí)時(shí)操控。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文注射位點(diǎn)神經(jīng)末梢，沿軸突逆向運(yùn)輸?shù)桨w，感染與之形成突觸連接的上（圖 1-2）(Broussard and Altschuler, 2000)。不同的嗜神經(jīng)病毒具有不同的用于環(huán)路標(biāo)記時(shí)需綜合考慮病毒的特性，包括感染的靶細(xì)胞的類(lèi)型，病毒，基因組大小，基因表達(dá)水平，轉(zhuǎn)運(yùn)速度，病毒滴度及病毒使用的安全性

單級(jí)輸出環(huán)路標(biāo)記示意圖

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;王得新編著《神經(jīng)病毒學(xué)基礎(chǔ)與臨床》出版[J];中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2001年01期

2 ;《神經(jīng)病毒學(xué)-基礎(chǔ)與臨床》第二版出版[J];中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué);2013年06期

3 ;《神經(jīng)病毒學(xué)—基礎(chǔ)與臨床》第二版出版[J];中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué);2012年05期

4 ;《神經(jīng)病毒學(xué)-基礎(chǔ)與臨床》第二版出版[J];中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué);2012年06期

5 王得新;神經(jīng)病毒病的診斷和治療原則[J];臨床薈萃;2004年21期

6 張志建;靳森;朱續(xù)濤;賈凡;王華東;劉青;何曉斌;徐富強(qiáng);;利用嗜神經(jīng)病毒跨突觸追蹤神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2014年06期

7 王得新;;神經(jīng)病毒學(xué)發(fā)展概況[J];中國(guó)現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志;2014年07期

8 Gibson C.S;MacLennan A.H;Goldwater P.N;江山;;嗜神經(jīng)病毒和腦癱:人群病例對(duì)照研究[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(神經(jīng)病學(xué)分冊(cè));2006年05期

9 曲陶然;屠逸琳;蘇儉生;;嗜神經(jīng)病毒示蹤成年小鼠開(kāi)頜反射神經(jīng)環(huán)路的實(shí)驗(yàn)研究[J];口腔頜面外科雜志;2018年05期

10 張兆欽;;散發(fā)性病毒性腦炎(附140例臨床分析)[J];福建醫(yī)藥雜志;1979年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 孫樂(lè)強(qiáng);嗜神經(jīng)病毒神經(jīng)嗜性和毒性比較[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 曾志磊;三種嗜神經(jīng)病毒的核酸檢測(cè)方法和初步流行病學(xué)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2772803