發(fā)布時間：2020-07-28 11:18

【摘要】：嗜神經(jīng)病毒是一類對神經(jīng)系統(tǒng)高度敏感的病毒,多種嗜神經(jīng)病毒具有嚴(yán)格的神經(jīng)嗜性,并且在感染后能夠沿特定方向跨突觸傳播。隨著基因工程和反向遺傳學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,嗜神經(jīng)病毒被改造為多種形式的環(huán)路標(biāo)記工具,用以解析中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)環(huán)路連接網(wǎng)絡(luò)。而且可結(jié)合鈣離子指示蛋白、光遺傳和化學(xué)遺傳工具特異性地監(jiān)測和操縱神經(jīng)環(huán)路的活性,對神經(jīng)環(huán)路的功能進(jìn)行研究。嗜神經(jīng)病毒在神經(jīng)元內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)方向具有一定的偏好性。單純皰疹病毒(HSV)的HSV129毒株和水泡性口炎病毒(VSV)主要以順行方向轉(zhuǎn)運(yùn),被作為神經(jīng)環(huán)路順向標(biāo)記工具�？袢《�(RABV),犬腺病毒2型(CAV),偽狂犬病毒(PRV)的bartha株和逆行標(biāo)記的腺相關(guān)病毒rAAV2-retro沿軸突逆行轉(zhuǎn)運(yùn),被改造用于神經(jīng)環(huán)路的逆向標(biāo)記。根據(jù)病毒的復(fù)制能力分為不跨突觸的標(biāo)記病毒和跨多級突觸的標(biāo)記病毒。不跨突觸的標(biāo)記病毒為復(fù)制缺陷型病毒,如G蛋白缺失的狂犬病毒(RABV-SAD-?G),E1蛋白缺失的犬腺病毒(CAV2)和rAAV2-retro,用以標(biāo)記注射位點(diǎn)的一級環(huán)路連接�？缍嗉壨挥|的標(biāo)記病毒為復(fù)制完整型病毒,包括PRV的bartha株、RABV的固定毒株、HSV的H129毒株,隨著病毒的復(fù)制,可跨突觸標(biāo)記核團(tuán)的多級環(huán)路。如此繁多的病毒標(biāo)記工具,使科研工作者能夠更全面的解析大腦的神經(jīng)連接以及信號傳遞模式。在不同的研究中該如何準(zhǔn)確的選擇有效的病毒工具,依賴于我們對不同病毒特性的了解。不同來源的標(biāo)記病毒具有不同特性,包括病毒結(jié)構(gòu)、基因組、受體蛋白、復(fù)制包裝等過程,病毒只能夠入侵表達(dá)對應(yīng)受體蛋白的神經(jīng)元,進(jìn)入神經(jīng)元后通過與宿主蛋白的相互作用,完成病毒的復(fù)制、包裝等過程。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由種類繁多的神經(jīng)元構(gòu)成,不同類型的神經(jīng)元的基因表達(dá)各不相同。以上病毒與宿主之間的差異可能會導(dǎo)致嗜神經(jīng)病毒對不同類群的神經(jīng)元具有不同的神經(jīng)嗜性,造成神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記的不一致。然而,目前對不同示蹤病毒的神經(jīng)嗜性比較,及其在環(huán)路標(biāo)記的影響并沒有系統(tǒng)的研究報道。本課題對目前常用的跨多級示蹤病毒和不跨突觸的示蹤的病毒的神經(jīng)嗜性和毒性進(jìn)行系統(tǒng)的分析比較,為神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記工具的合理應(yīng)用提供參考。1.多級逆行示蹤病毒神經(jīng)嗜性比較將表達(dá)綠色熒光蛋白的RABV的固定毒來源的CVS-B2c-EGFP和PRV Bartha株來源的PRV-152(EGFP)分別注射在小鼠的乆淋巴結(jié)。病毒粒子被支配淋巴結(jié)的神經(jīng)末吸收后沿神經(jīng)纖維逆行標(biāo)記支配淋巴結(jié)的神經(jīng)元,隨著病毒的復(fù)制和跨突觸感染,大腦內(nèi)的高級神經(jīng)連接網(wǎng)絡(luò)被標(biāo)記。通過全腦切片成像,對兩種病毒標(biāo)記的神經(jīng)元的核團(tuán)位置和數(shù)量進(jìn)行分析比較,結(jié)果顯示通過以上兩種逆向標(biāo)記病毒繪制的神經(jīng)環(huán)路存在差異。2.單級逆行示蹤病毒神經(jīng)嗜性比較將幾種常用的復(fù)制缺陷型病毒SAD-?G、rAAV2-retro、CAV2-Cre以及一種化學(xué)示蹤劑green retrobeads分別注射在鼠腦的相同核團(tuán),標(biāo)記注射位點(diǎn)的一級輸入環(huán)路。通過全腦切片、成像,對不同病毒標(biāo)記的神經(jīng)元的核團(tuán)和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同病毒標(biāo)記的神經(jīng)環(huán)路并不完全一致。進(jìn)一步通過Cre/Lox重組酶系統(tǒng)放大熒光蛋白信號排除不同病毒熒光蛋白表達(dá)差異;通過混合注射,排除注射誤差后,依然能夠觀察到標(biāo)記差異。這說明不同的標(biāo)記病毒對大腦內(nèi)的神經(jīng)元類群存在嗜性偏好。在對下丘腦的環(huán)路進(jìn)行標(biāo)記時,rAAV2-retro更傾向于標(biāo)記皮層,而SAD-?G傾向于標(biāo)記下丘腦和基底神經(jīng)節(jié)。3.病毒神經(jīng)嗜性差異機(jī)制的初步探索病毒利用細(xì)胞膜上的受體感染進(jìn)入神經(jīng)元,不同類型的病毒只識別并結(jié)合其對應(yīng)的特異受體蛋白。而且大腦內(nèi)的神經(jīng)元種類繁多、功能各異,基因表達(dá)必定存在差異。因此,我們推測病毒具有神經(jīng)嗜性差異的重要因素是神經(jīng)元軸突末梢的病毒受體表達(dá)不均一,從而造成病毒對不同類群的神經(jīng)元具有選擇性。我們在RABV不敏感的神經(jīng)元過表達(dá)禽白血病病毒受體(TVA)后,能夠明顯提高對應(yīng)配體EnvA(禽白血病病毒囊膜蛋白)假包裝的狂犬病毒的感染性。這說明神經(jīng)元表達(dá)對應(yīng)病毒受體后,能夠提高該病毒的神經(jīng)嗜性。為了進(jìn)一步探索決定神經(jīng)嗜性的分子機(jī)制,我們建立了鼠腦神經(jīng)元的單細(xì)胞分離方法,分離SAD-?G和rAAV2-retro標(biāo)記的神經(jīng)元,并進(jìn)行單細(xì)胞測序。對22群SAD-?G標(biāo)記的神經(jīng)元和21群rAAV2-retro標(biāo)記的神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,推測造成兩種病毒神經(jīng)嗜性差異的分子機(jī)制。4.示蹤病毒的毒性比較示蹤病毒注射后由于病毒的感染和基因的表達(dá)勢必會對腦組織產(chǎn)生一定的毒性。我們首先通過組織RNA-seq對注射位點(diǎn)和逆標(biāo)記位點(diǎn)組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序,分析病毒標(biāo)記對腦組織基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示病毒標(biāo)記誘導(dǎo)大量免疫相關(guān)基因的表達(dá),SAD-?G對注射位點(diǎn)和逆標(biāo)記位點(diǎn)的基因表達(dá)的改變比rAAV2-retro更顯著。進(jìn)而通過免疫組織化學(xué)染色觀察到SAD-?G標(biāo)記后在注射位點(diǎn)和逆標(biāo)記位點(diǎn)出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的大量激活,rAAV2-retro僅在注射位點(diǎn)引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,而在逆標(biāo)記位點(diǎn)并未出現(xiàn)明顯的激活現(xiàn)象。同時我們還發(fā)現(xiàn)SAD-?G逆標(biāo)記會引起催產(chǎn)素基因的高表達(dá)。5.多種示蹤病毒聯(lián)合應(yīng)用標(biāo)記高級神經(jīng)環(huán)路通過以上研究我們發(fā)現(xiàn),不同來源的示蹤病毒的神經(jīng)嗜性存在差異。我們利用病毒的神經(jīng)嗜性差異,對多種單級示蹤病毒聯(lián)合應(yīng)用,提出解析特定核團(tuán)的二級輸入環(huán)路策略。本研究通過比較不同嗜神經(jīng)病毒對大腦內(nèi)神經(jīng)元的感染特性,確定嗜神經(jīng)病毒對大腦內(nèi)的神經(jīng)元存在嗜性差異,并且通過單細(xì)胞測序分析造成病毒神經(jīng)嗜性差異的分子機(jī)制。同時比較了不同嗜神經(jīng)病毒改造的神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記工具在腦組織內(nèi)產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。以上研究為嗜神經(jīng)病毒感染機(jī)制研究提供新的思路,同時也為嗜神經(jīng)病毒在神經(jīng)環(huán)路中的正確應(yīng)用提供參考。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

嗜神經(jīng)病毒神經(jīng)嗜性和毒性比較毒能夠隨著病毒的復(fù)制跨突觸感染多級神經(jīng)元(Card and Enquist, 2001; Tang999)。以上優(yōu)勢使嗜神經(jīng)病毒成為環(huán)路標(biāo)記中的新生力量。隨著基因工程技毒反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展，可對嗜神經(jīng)病毒的核酸序列進(jìn)行人工編輯，改的特性，包括對病毒轉(zhuǎn)運(yùn)方向和跨突觸能力的控制。還可以在病毒基因組插蛋白等標(biāo)記基因，結(jié)合熒光顯微鏡的使用，避免了免疫組織化學(xué)顯色的繁瑣golini, 2010)。攜帶多種功能蛋白的嗜神經(jīng)病毒可實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)環(huán)路功能的實(shí)時操控。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文注射位點(diǎn)神經(jīng)末梢，沿軸突逆向運(yùn)輸?shù)桨w，感染與之形成突觸連接的上（圖 1-2）(Broussard and Altschuler, 2000)。不同的嗜神經(jīng)病毒具有不同的用于環(huán)路標(biāo)記時需綜合考慮病毒的特性，包括感染的靶細(xì)胞的類型，病毒，基因組大小，基因表達(dá)水平，轉(zhuǎn)運(yùn)速度，病毒滴度及病毒使用的安全性

單級輸出環(huán)路標(biāo)記示意圖

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1 ;王得新編著《神經(jīng)病毒學(xué)基礎(chǔ)與臨床》出版[J];中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2001年01期

2 ;《神經(jīng)病毒學(xué)-基礎(chǔ)與臨床》第二版出版[J];中國臨床神經(jīng)科學(xué);2013年06期

3 ;《神經(jīng)病毒學(xué)—基礎(chǔ)與臨床》第二版出版[J];中國臨床神經(jīng)科學(xué);2012年05期

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本文編號：2772803