【摘要】：片形吸蟲的兩個致病種大片形吸蟲和肝片形吸蟲均能感染人和哺乳動物引起片形吸蟲病,不同宿主的易感性不同,這與片形吸蟲對宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控或逃避有關(guān)。肝片形吸蟲及其ESP已被證實能誘導(dǎo)小鼠和牛巨噬細(xì)胞的M2型極化,而大片形吸蟲在宿主中能否引起相似的免疫反應(yīng)尚無明確的結(jié)論。本研究旨在通過體內(nèi)外試驗探討大片形吸蟲及其ESP在不同宿主引起的巨噬細(xì)胞極化和固有免疫反應(yīng)的差異及其免疫機制,并將淋巴插管模型應(yīng)用于片形吸蟲ESP對宿主免疫細(xì)胞的作用研究,以探明片形吸蟲及其ESP對宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控機制,為理解大片形吸蟲與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用提供可靠的理論基礎(chǔ)。本研究取得以下成果:1.用大片形吸蟲囊蚴感染水牛、昆明小鼠(KM)和C57BL/6Nju小鼠(B6),分別于水牛感染后4周、10周、14周和小鼠感染后3周、4周、7或8周處死。通過肝組織切片觀察到水牛和小鼠肝臟均能從炎癥浸潤向結(jié)締組織增生轉(zhuǎn)歸,水牛感染14周可見肝內(nèi)肉芽組織和成蟲形成。實時熒光定量PCR檢測肝臟枯否細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)分子標(biāo)志和細(xì)胞因子mRNA表達量,并用ELISA檢測血清IFN-γ和IL-4,結(jié)果顯示:隨著感染病程的加劇水�？莘窦�(xì)胞表型從M2型極化向M1、M2型共上調(diào)的趨勢轉(zhuǎn)變,KM小鼠枯否細(xì)胞表型則由前期的M1+M2混合型向M0型轉(zhuǎn)歸,而B6小鼠則表現(xiàn)為更明顯的M2型極化。結(jié)果表明:大片形吸蟲感染水牛和小鼠可誘導(dǎo)肝臟KC表型和細(xì)胞因子的表達變化存在較大宿主差異,這些變化的宿主差異是與不同宿主肝臟的載蟲能力、損傷修復(fù)能力、病變程度以及蟲體在宿主體內(nèi)移行、發(fā)育密切相關(guān)的。2.用大片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物200μg FgESP腹腔注射KM小鼠和B6小鼠,4天、7天隔日注射作為短期試驗組,14周每周注射作為長期試驗組,注射PBS為對照。通過肝組織切片觀察到FgESP腹腔短期注射不會引起小鼠肝臟明顯的組織學(xué)變化,而長期注射會導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加、結(jié)締組織增生和纖維化趨勢。實時熒光定量PCR檢測肝臟枯否細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)分子標(biāo)志和細(xì)胞因子mRNA表達量,結(jié)果顯示:KM小鼠短期注射FgESP會引起肝組織iNOSmRNA表達下調(diào),但B6小鼠CD206、Arg-2、YM-1的表達上調(diào),兩種小鼠枯否細(xì)胞均表現(xiàn)出M2型極化優(yōu)勢;兩種小鼠長期注射FgESP則引起完全不同的KCs表型趨勢,其中KM小鼠表現(xiàn)為M1和M2型同時上調(diào)的混合型,B6則表現(xiàn)為M1和M2均沒變化的M0型。3.用200 gg/mL大片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物FgESP體外刺激水牛原代BLMΦ和B6小鼠來源的傳代iPMΦ(野生型)兩類MΦ48小時。實時熒光定量PCR測定兩類巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)志和細(xì)胞因子mRNA表達量,化學(xué)法測定細(xì)胞Arg-1,Griess法測定細(xì)胞上清NO濃度,ELISA測定上清IFN-γ、IL-4濃度,結(jié)果顯示:水牛BLMΦCD68基因表達下調(diào)、Arg-2基因表達上調(diào),Arg-1、NO的合成增加,上清中的IFN-γ濃度下降、IL-4沒有明顯變化,提示可能存在M2型極化和細(xì)胞激活的抑制或凋亡的發(fā)生;小鼠野生型iPMΦA(chǔ)rg-1合成增加,上清中的IL-4濃度顯著升高,而IFN-γ、NO濃度沒有變化,也提示M2型極化。結(jié)果表明:FgESP體外刺激不同宿主MΦ均能誘導(dǎo)M2型極化。4.用2000μg/mL FgESP分別體外刺激B6小鼠來源的基因敲除iPMΦ(MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-、TLR-2/4-/-),測定上清NO、IFN-γ、IL-4濃度和細(xì)胞裂解物的Arg-1含量,并與野生型iPMΦ進行比較,結(jié)果顯示:MyD88的缺失導(dǎo)致IL-4的分泌與對照組無差異,而MyD88、TRIF同時缺失導(dǎo)致IL-4的分泌減少,兩者均低于野生型iPMΦ;無論是MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-還是TLR-2/4-/-iPMΦ,FgESP體外刺激誘導(dǎo)的Arg-1產(chǎn)量均與對照組無差異。結(jié)果表明:FgESP體外刺激小鼠傳代巨噬細(xì)胞能誘導(dǎo)依賴于MyD88及其相關(guān)通路的M2型激活,促進Th2型細(xì)胞因子分泌,促進Arg-1合成和NO分泌抑制,而TRIF和TLR2、TLR4也有可能以某種方式發(fā)揮作用。5.通過外科手術(shù)成功構(gòu)建綿羊的股骨前偽輸入淋巴插管、肝臟輸入淋,巴插管,成功率分別為約70%和33%左右。6.將200μg熒光標(biāo)記的肝片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物FhESP于綿羊股骨前區(qū)域多點皮下注射(OVA設(shè)為對照抗原),并通過股骨前偽輸入淋巴插管收集0～7天不同時間點的淋巴液并分離免疫細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析免疫細(xì)胞種類和抗原吞噬細(xì)胞的比例,熒光實時定量PCR測定巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)志mRNA表達量,ELISA測定淋巴液的IFN-γ和IL-4,結(jié)果顯示:FhESP注射刺激能使股骨前輸入淋巴中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的比例分別在注射后4～8小時和8～12小時特異性升高,淋巴細(xì)胞的比例在注射后4～8小時特異性降低,DCs的比例在注射后4～8小時升高但與OVA對照抗原相比缺乏統(tǒng)計學(xué)差異,嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的比例在各時間點無明顯改變;抗原吞噬細(xì)胞的數(shù)量在注射后4～12h的短暫提高,其中,嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞對FhESP的早期吞噬具有特異性,但DCs的兩個亞群的比例變化不具抗原特異性;FhESP刺激能導(dǎo)致淋巴液分離到的細(xì)胞M2型分子標(biāo)志CD206、Arg-2和YM-1的表達均在刺激后24小時內(nèi)特異性上調(diào),淋巴液IL-4在0～8h特異性升高,IFN-γ、IL-10、IL-12的含量沒有特異性變化。結(jié)果表明:綿羊股骨前偽輸入淋巴插管操作簡單,成功率高,適用于免疫反應(yīng)動力學(xué)試驗,通過該模型我們發(fā)現(xiàn)FhESP能在綿羊體內(nèi)促進單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的快速招募,提高吞噬細(xì)胞抗原吞噬能力,特異性誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化和Th2細(xì)胞因子分泌。綜上所述,本文認(rèn)為大片形吸蟲感染導(dǎo)致肝臟枯否細(xì)胞表型極化趨勢和細(xì)胞免疫應(yīng)答趨勢存在較大的宿主差異,主要取決于宿主肝臟的載蟲能力、損傷修復(fù)能力和病變進程。大片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物FgESP則能在體、內(nèi)外誘導(dǎo)動物宿主巨噬細(xì)胞依賴于MyD88信號通路的M2型極化,并刺激分泌Th2型細(xì)胞因子,通過上調(diào)Arg-1抑制NO分泌降低巨噬細(xì)胞清除病原的能力,可能是大片形吸蟲逃避巨噬細(xì)胞免疫殺傷的策略。此外,在綿羊身上成功構(gòu)建并應(yīng)用偽輸入淋巴插管模型研究肝片形吸蟲分泌排泄產(chǎn)物FhESP對宿主免疫細(xì)胞的作用,發(fā)現(xiàn)FhESP具有早期招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞、提高吞噬細(xì)胞早期抗原吞噬、誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞和Th2型細(xì)胞免疫的能力。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.7
【圖文】：

邐■泄對巨答作用究逡逑的不同（分別為促炎和抗炎）。１＾３１？（＾３１１丨１８９］根據(jù)誘導(dǎo)物和功能不同，將Ｍ２ＭＯ進一步逡逑分為ａ、ｂ、ｃ三個亞群（圖１－１）。其中，Ｍ２ａ誘導(dǎo)物為ＩＬ－４和ＩＬ１３，表現(xiàn)為抗寄生蟲逡逑和組織修復(fù)，即典型的Ｍ２Ｍｄ＞；邋Ｍ２ｂ誘導(dǎo)物為ＩＬ－１Ｒ／ＴＬＲ配體和免疫復(fù)合物如ＬＰＳ和逡逑１Ｃ，可產(chǎn)生細(xì)胞毒分子并保護宿主免受內(nèi)毒素毒性，也稱ｔｙｐｅ邋ＩＩ邋ＭＯ；邋Ｍ２ｃＭ０＞刺激物逡逑為ＴＧＦ－ｐ、ＩＬ－１０和ＧＣ，可能涉及異源Ｍ＜Ｄ失活【９Ｑ】。Ｍ２ａＭＯ、Ｍ２ｃＭ￥均表現(xiàn)為抗炎逡逑效應(yīng)；Ｍ２ｂＭ０＞則類似Ｍ１Ｍ＜Ｄ，能分泌高水平的促炎癥因子，但仍具有Ｍ２Ｍ０＞的表型逡逑特征【８９】，對炎癥進行抑制或負(fù)調(diào)控。有意思的是，組學(xué)研宄發(fā)現(xiàn)Ｍ１Ｍ０極化會造成轉(zhuǎn)逡逑錄組的明顯變化，而Ｍ２Ｍ０極化對轉(zhuǎn)錄組影響甚微［８９，９１］。有研宄稱Ｍ２ＭＯ可能與內(nèi)毒逡逑素耐受有關(guān)［９２】。ＲＭＯ則與Ｍ１ＭＯ、Ｍ２ＭＯ完全不同，ＩＬ４／ＩＬ－１３和ＩＦＮ－ｙ兩類通路在逡逑ＲＭＯ激活過程中都起作用

論文邐對巨答作用？為世界衛(wèi)生組織ＷＨＯ于２０１３年公布的統(tǒng)計結(jié)果，圖１－２下為國際健康風(fēng)險ＢＶＧＨ于２０１５年公布的統(tǒng)計結(jié)果），人片形吸蟲病的流行范圍幾乎遍及全帶），且呈擴大趨勢。流行范圍的擴大可能與全球氣候變暖、夏季降雨量激１７６］。重度流行區(qū)集中在安第斯山脈、加勒比海、北非、西歐以及里海一帶；國、日本、菲律賓和韓國為主［ｍ］。除疫源地散發(fā)病例，還有一些是通過人口流如２０１５年澳大利亞６名澳洲人從印尼旅行歸國后查出片形吸蟲感染，推測原過疫源地的生鮮蔬菜［１７７１�，F(xiàn)代社會愈發(fā)頻繁的人口流動（遷居、旅行、務(wù)工逡逑造成疫源地的加速擴大的最可能因素之一。逡逑

．１宿主感染大片形吸蟲后的肝臟組織病理學(xué)逡逑（１）水牛感染大片形吸蟲的肝臟組織病理學(xué)觀察逡逑如圖２－１－１所示，本地水牛在感染大片形吸蟲４邋ｗｐｉ肝組織內(nèi)即已出現(xiàn)大量的炎癥逡逑胞浸潤；肝索排列紊亂，匯管區(qū)結(jié)締組織增生，肝小葉間質(zhì)充血；肝細(xì)胞呈現(xiàn)腫脹，逡逑的甚至出現(xiàn)了空泡變性。１０邋ｗｐｉ，炎性細(xì)胞相對減少，但仍可見間質(zhì)充血；結(jié)締組織逡逑近大量浸潤纖維母細(xì)胞，并逐漸生成旋渦狀生長的成纖維細(xì)胞，啟動損傷組織的修復(fù)；逡逑現(xiàn)空泡的肝細(xì)胞數(shù)量下降。１４邋ｗｐｉ，先前損傷的組織局部己經(jīng)變成結(jié)構(gòu)模糊的肉芽組逡逑，這些組織周圍纖維細(xì)胞輪廓不清晰；間質(zhì)充血減輕；肝索排列緊致，肝血竇中的紅逡逑胞和ＫＣｓ的數(shù)量明顯增多。逡逑油鏡圖（ｌＯＯＯｘ）箭頭所示為肝臟中的ＫＣｓ，經(jīng)Ｈ＆Ｅ染色后細(xì)胞核藍色深染，胞漿逡逑淺藍紫色，形狀多為不規(guī)則或橢圓，多充斥于肝索之間的肝血竇中。對比大片形吸蟲逡逑入肝臟到定植于膽管的過程中ＫＣｓ的形態(tài)變化，可見４邋ｗｐｉ和１０邋ｗｐｉ感染組的ＫＣｓ逡逑為伸出偽足后的梭形或多邊形，具有徖移運動的趨勢；而１４邋ｗｐｉ感染組的ＫＣｓ則更逡逑向于跟對照組類似的橢圓形或球形，推測可能與更強的分泌功能有關(guān)。逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2770777