【摘要】：自1996年首次在廣東的鵝體內(nèi)分離鑒定出H5N1亞型高致病性禽流感病毒(Avian influenzavirus,AIV)A/Goose/Guangdong/1/1996(Gs/GD/1996)以來,該亞型病毒一直在我國(guó)存在,感染野禽和家禽。H5亞型高致病性AIVs除引起家禽的高發(fā)病率和死亡率外,還可以偶爾跨種間傳播引起人的高病死率。近年來H5N1病毒與多個(gè)不同亞型的神經(jīng)氨酸酶基因重配為新型H5Nx病毒(包括H5N2、H5N6及H5N8等),其中H5N8亞型AIVs地理分布廣泛。因此,了解新出現(xiàn)的H5N8病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性并鑒定出高致病性分子標(biāo)記對(duì)該病毒的預(yù)測(cè)預(yù)警具有重要意義。本研究中,我們篩選出2株遺傳背景相似但對(duì)小鼠致病力存在顯著差異的H5N8 AIVs,測(cè)定了其生物學(xué)特性,并解析了導(dǎo)致2株病毒致病力差異的分子機(jī)制及宿主因素。1.對(duì)小鼠致病力存在差異的H5N8亞型AIVs的篩選及生物學(xué)特性的測(cè)定對(duì)實(shí)驗(yàn)室2012-2014年間分離的不同宿主來源的10株H5N8 AIVs進(jìn)行小鼠致病力測(cè)定,并從中篩選出2株對(duì)小鼠致病力有顯著差異的病毒A/goose/Easter China/CZ/2013(CZ)和A/duck/EasternChina/JY/2014(JY)作為模式病毒。HA基因遺傳進(jìn)化及基因組差異分析表明2株模式病毒同屬2.3.4.4分支,全基因組僅存在25個(gè)氨基酸差異。受體結(jié)合能力測(cè)定表明,2株病毒都具有α-2,3及α-2,6雙受體結(jié)合特性。體外病毒生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)表明,2株病毒在CEF細(xì)胞上均能有效復(fù)制,滴度可達(dá)到約8 log10TCID50/mL;而在MDCK細(xì)胞上,CZ病毒可以有效復(fù)制,最高滴度約為7 log1oTCID50/mL;JY病毒生長(zhǎng)受限,最高滴度小于4 log1C0TCID50/mL。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明,2株病毒雖然對(duì)SPF雞來說都是高致病性的,對(duì)小鼠的致病性卻不同。CZ對(duì)小鼠是高致病性的(MLD50=101.6EID50),JY對(duì)小鼠則是低致病性的(MLD50106.5 EID50)。2.PB2蛋白283M和526R協(xié)同作用增強(qiáng)H5N8亞型AIVs對(duì)小鼠的致病力分別以CZ和JY為骨架構(gòu)建了一系列單基因替換重組病毒并測(cè)定其對(duì)小鼠的致病力。結(jié)果顯示,當(dāng)CZ病毒骨架中替換入JY病毒PB2、PB1和PA基因后,病毒對(duì)小鼠的毒力明顯降低;然而,JY骨架中只有替換入CZ病毒PB2基因后(JY-CZPB2),病毒對(duì)小鼠的毒力才有所增強(qiáng)。通過對(duì)模式病毒PB2基因上差異氨基酸的相互定點(diǎn)突變,我們證明了PB2 283M及526R增強(qiáng)了病毒的聚合酶活性、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(MDCK)上的復(fù)制效率以及對(duì)小鼠的致病性。進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)這2個(gè)氨基酸在H5N1亞型AIV中也發(fā)揮相同的作用。因此,283位甲硫氨酸(M)是H5N8亞型AIVs中一個(gè)新的哺乳動(dòng)物致病力分子標(biāo)記,且其同526位精氨酸(R)協(xié)同作用是導(dǎo)致H5N8病毒對(duì)小鼠高毒力的關(guān)鍵因素。3.H5N8病毒PB2蛋白I283M及K526R突變?cè)鰪?qiáng)病毒對(duì)小鼠致病力的宿主因素分析母本病毒r-JY以及突變病毒JYPB2-1283M-K526R感染小鼠3 d后,采集樣品利用RNA-seq的方法分析宿主(小鼠肺臟)和病原體的雙轉(zhuǎn)錄組水平。結(jié)果顯示,JYPB2-I283M-K526R 感染組中宿主顯著性差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目以及表達(dá)水平均高于r-JY感染組。GO富集分析表明,r-JY感染組DEGs的功能主要與應(yīng)激應(yīng)答、防御應(yīng)答以及免疫應(yīng)答相關(guān),而JYPB2-1283M-K526R感染組DEGs的功能主要與應(yīng)激應(yīng)答、免疫系統(tǒng)過程以及蛋白結(jié)合相關(guān),且突變病毒組免疫相關(guān)基因的富集數(shù)是母本病毒組的4倍左右。基因表達(dá)熱圖顯示,突變病毒感染組的大部分免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著高于母本病毒感染組,暗示突變病毒可以在小鼠肺臟中誘導(dǎo)過激的天然免疫應(yīng)答。此外,相比于r-JY以及健康對(duì)照組,JYPB2-1283M-K526R可以在感染后3 d誘導(dǎo)小鼠肺臟更強(qiáng)烈的細(xì)胞凋亡。病毒轉(zhuǎn)錄組序列分析顯示突變病毒感染組小鼠肺臟中病毒基因的表達(dá)水平顯著高于母本病毒感染組,這與突變病毒感染小鼠后其肺臟中檢測(cè)出更高的病毒滴度相一致。綜上所述,PB2蛋白283M及526R的協(xié)同作用是增強(qiáng)H5N8病毒對(duì)小鼠致病力的分子基礎(chǔ)。此外,CZ病毒對(duì)小鼠的高致病性與其誘導(dǎo)的異常宿主天然免疫應(yīng)答相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

組片段形成ｖＲＮＰ復(fù)合體，即病毒各片段一端與異源三聚體ＲＮＡ依賴性ＲＮＡ聚合酶（ＲＮＡ逡逑ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ＲＮＡ邋ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＲｄＲｐ，由ＰＢ２、ＰＢ１和ＰＡ組成）結(jié)合，另一端與小環(huán)狀核蛋逡逑白ＮＰ結(jié)合，剩余部分則被反向平行的雙螺旋形式的ＮＰ蛋白包裹［１＿３］（圖１）。ｖＲＮＰ復(fù)合逡逑體是病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的基本功能單位［４＿６］。到目前為止，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ＩＡＶｓ編碼蛋白包括１０逡逑種必需蛋白（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍｌ、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ／ＮＳ２）和邋７邋種非必需逡逑的附件蛋白（ＰＢ１－Ｆ２、Ｎ４０、ＰＡ－Ｘ、ＰＡ－Ｎ１５５、ＰＡ－Ｎ１８２、Ｍ４２邋和邋ＮＳ３）邋［７－１２］。其中血凝素逡逑（ＨＡ）和神經(jīng)氨酸酶（ＮＡ）是２種主要的糖蛋白，也是病毒的表面抗原。根據(jù)Ｈ和Ｎ的逡逑不同，ＩＡＶｓ可分為不同亞型，目前已鑒定出１８種ＨＡ和１１種ＮＡ亞型［１３＿１５］。流感病毒Ｍ逡逑基因主要編碼兩種蛋白，分別為基質(zhì)蛋白Ｍｌ和離子通道蛋白Ｍ２。Ｍｌ蛋白的主要功能之逡逑一是參與ｖＲＮＰ復(fù)合體輸出細(xì)胞核的過程［１６］。此外，在流感病毒最后的包裝階段，Ｍｌ蛋逡逑白與ＨＡ、ＮＡ或Ｍ２蛋白的胞質(zhì)區(qū)作用而被帶到細(xì)胞膜脂閥的包裝和出芽位點(diǎn)，并與細(xì)胞逡逑膜結(jié)合［１６］。在病毒感染早期，Ｍ２蛋白通過調(diào)節(jié)病毒顆粒中的ｐＨ值，促使ｖＲＮＰ復(fù)合體與逡逑

——頂部細(xì)胞質(zhì)膜［２９＿３１］。最終，成熟的病毒粒子和大量宿主蛋白結(jié)合，通過出芽方式釋放逡逑（圖２）。逡逑ｍＷ逡逑ｒ邐１邐＼逡逑Ｉ邐Ｖｉｒａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邐＼逡逑ｉｅ—｜邐＼逡逑｜邋題國(guó)但逡逑邐邐ＪＩ＾＞ｓｓｓ＝＝！Ｓ�。螅澹海Γ撸螅剑В剑悖В茫剑幔剑剑剑。剑海螅螅椋海ィ幔蓿掊义希ǎ蔬娨贿姡澹桑溴义希蛇娬\(chéng)■，＂？、、ｅ｜邐pc嫌ｒａ，逡逑＼邐ＣＲＮ？逡逑圖２流感病毒的生命周期模式圖（引自Ｖｅｌｔｈｕｉｓ，２０１６）逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｌｉｆｅ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ａ邋ｖｉｒｕｓ逡逑１．３邋ＩＡＶｓ聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能逡逑以前，人們對(duì)負(fù)鏈ＲＮＡ病毒聚合酶在結(jié)構(gòu)方面的分析非常困難，主要是因?yàn)樗鼈兎皱义献恿看�，在重組系統(tǒng)中表達(dá)量少；對(duì)于流感病毒來說，聚合酶由多個(gè)亞基組成，結(jié)構(gòu)又比逡逑較復(fù)雜。近年來，由于冷凍電鏡技術(shù)及Ｘ射線晶體學(xué)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，加之大分子蛋白或逡逑復(fù)合物表達(dá)純化方法的發(fā)展，人們對(duì)流感病毒聚合酶的結(jié)構(gòu)有了更深層次的研究。這些新逡逑發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)為我們探索由聚合酶參與的分子機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)［３Ｍ５］。逡逑高分辨率Ｘ射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)表明

與ＰＡ蛋白Ｃ端相互作用，Ｃ端則與ＰＢ２蛋白Ｎ端相互作用［３４＇３６，３７］。然而，隨著結(jié)構(gòu)技術(shù)逡逑的發(fā)展，研宄人員發(fā)現(xiàn)流感病毒聚合酶復(fù)合體的３個(gè)亞單位是相互纏繞的，因此，其互作逡逑區(qū)域可能比之前發(fā)現(xiàn)的更為廣泛［３Ｍ（）］（圖３）。逡逑

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本文編號(hào)：2770347