【摘要】：豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)是一種典型的嗜神經(jīng)性冠狀病毒,其主要感染3周齡以內(nèi)的哺乳仔豬,可引起腦脊髓炎,呈現(xiàn)明顯抽搐、嘔吐等臨床癥狀,死亡率可達(dá)100%。該病毒主要侵害神經(jīng)系統(tǒng),但其所致神經(jīng)損傷的機(jī)制尚未完全闡明。微絲(纖維形肌動(dòng)蛋白,F-actin)作為真核細(xì)胞細(xì)胞骨架的重要組成部分,是病原體進(jìn)入宿主細(xì)胞的第一個(gè)物理屏障。神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能主要取決于F-actin的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),PHEV通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞依賴于F-actin的完整性。F-actin是否參與PHEV入侵過程,以及F-actin結(jié)構(gòu)改變對(duì)PHEV復(fù)制的影響及其在侵襲過程中的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。因此,從F-actin角度探討PHEV誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的機(jī)制不僅有助于闡明PHEV的發(fā)病機(jī)制,而且為尋找新的抗病毒靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)在PHEV感染小鼠神經(jīng)瘤母(Neuro-2a,N2a)細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,利用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒感染早期不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞F-actin結(jié)構(gòu)變化情況。與接種滅活病毒細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞相比,在PHEV感染期間,F-actin結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出應(yīng)力纖維溶解、絲狀偽足和片狀偽足逐漸形成,隨后應(yīng)力纖維再次形成的動(dòng)態(tài)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,F-actin在病毒感染后5 min(mpi)快速聚合,然后在20 mpi開始解聚。這些結(jié)果表明PHEV感染N2a細(xì)胞早期可引起F-actin骨架重塑。隨后,利用間接免疫熒光和qRT-PCR方法檢測(cè)PHEV進(jìn)入動(dòng)力學(xué)。結(jié)果顯示,病毒顆粒沿著絲狀偽足移動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞,且病毒進(jìn)入主要發(fā)生在15 mpi,推測(cè)F-actin結(jié)構(gòu)重塑可能與病毒進(jìn)入相關(guān)。進(jìn)而利用Cyto D預(yù)處理細(xì)胞破壞F-actin結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化,qRT-PCR、Western blotting、間接免疫熒光及病毒生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)其對(duì)病毒進(jìn)入和增殖的影響。結(jié)果表明,Cyto D以劑量依賴性方式抑制病毒進(jìn)入且降低病毒滴度,證實(shí)PHEV進(jìn)入細(xì)胞與其引起的F-actin骨架結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)。Cofilin為細(xì)胞骨架解聚因子家族中重要的調(diào)控蛋白,可通過切割F-actin調(diào)控其動(dòng)態(tài)變化。為進(jìn)一步明確F-actin發(fā)揮作用的途徑,本實(shí)驗(yàn)對(duì)cofilin在PHEV進(jìn)入N2a細(xì)胞過程中的作用進(jìn)行研究。利用Western blotting和間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)病毒進(jìn)入過程中cofilin激活情況。結(jié)果顯示,cofilin活性出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化,與F-actin變化趨勢(shì)一致,推測(cè)其可能參與PHEV侵入細(xì)胞的過程。進(jìn)而將cofilin siRNA、cofilin-WT(野生型)、cofilin-S3A(激活型)、cofilin-S3D(失活型)過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞后再接種PHEV,利用qRT-PCR、Western blotting和間接免疫熒光法檢測(cè)病毒進(jìn)入量及F-actin變化情況。結(jié)果顯示,cofilin siRNA和三種過表達(dá)載體均抑制病毒進(jìn)入,表明PHEV有效進(jìn)入細(xì)胞需要借助cofilin動(dòng)態(tài)磷酸化而非其某一固定狀態(tài);此外,siRNA可破壞細(xì)胞應(yīng)力纖維并使細(xì)胞表面形成小突起,且PHEV可減少因增強(qiáng)cofilin活性引起的棒狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生,證實(shí)cofilin活性影響PHEV誘導(dǎo)F-actin骨架變化和病毒進(jìn)入過程。同時(shí),檢測(cè)cofilin上游激酶LIMK在PHEV感染過程中的激活情況及其對(duì)病毒進(jìn)入的影響。結(jié)果顯示,LIMK活性同樣出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化,且趨勢(shì)與cofilin活性變化趨勢(shì)一致;降低細(xì)胞內(nèi)源性LIMK表達(dá)可抑制病毒進(jìn)入,表明LIMK作為cofilin上游激酶調(diào)控PHEV侵入細(xì)胞的過程。受體酪氨酸激酶(RTKs)、整合素(integrins)、G蛋白偶聯(lián)受體等信號(hào)分子均可參與F-actin細(xì)胞骨架調(diào)控過程。為進(jìn)一步研究F-actin介導(dǎo)PHEV入侵N2a細(xì)胞的分子機(jī)制,選用針對(duì)上述多種信號(hào)分子的特異性化學(xué)抑制劑,分別阻斷由其介導(dǎo)的信號(hào)通路,利用qRT-PCR、Western blotting、GST-pull down和間接免疫熒光法分析不同信號(hào)分子對(duì)cofilin活性及PHEV入侵的影響。結(jié)果顯示,RTKs信號(hào)分子不參與病毒入侵過程;integrinα5β1不僅在PHEV附著時(shí)累積,而且還促進(jìn)下游激酶FAK和PI3K/Akt信號(hào)通路的活化;Src激酶不參與病毒誘導(dǎo)的F-actin骨架重排過程,也不影響cofilin活性,說明PHEV使用獨(dú)立于Src家族的FAK信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)F-actin骨架重排;Rac 1和Cdc 42 GTPases為integrinα5β1-FAK途徑的下游Rho GTPases,并且Rac 1和Cdc 42 GTPases都通過調(diào)節(jié)下游PAK 1分子來影響F-actin骨架重排和cofilin活性;Rho A作為integrinα5β1-PI3K/Akt途徑的下游靶蛋白,并且通過調(diào)控下游ROCK激酶來影響F-actin骨架重排和cofilin活性。上述結(jié)果證實(shí),PHEV通過integrinα5β1信號(hào)分子的FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK及PI3K/Akt-Rho A-ROCK-LIMK兩條信號(hào)通路協(xié)同作用來促進(jìn)cofilin磷酸化進(jìn)而誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白聚合,促進(jìn)PHEV高效進(jìn)入N2a細(xì)胞;隨后病毒穿透細(xì)胞膜又激活cofilin,調(diào)節(jié)應(yīng)力纖維的形成以促進(jìn)病毒運(yùn)輸。Integrinα5β1信號(hào)分子為PHEV進(jìn)入N2a細(xì)胞的關(guān)鍵分子,為研究其在體內(nèi)對(duì)病毒感染的作用,本實(shí)驗(yàn)在PHEV感染小鼠模型的基礎(chǔ)上,檢測(cè)integrinα5β1信號(hào)分子及下游通路激活情況。結(jié)果顯示,integrinα5β1表達(dá)量在病毒感染小鼠過程中增加,與細(xì)胞水平結(jié)果相一致;FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK通路被激活,而PI3K/Akt-Rho A-ROCK-LIMK通路未被完全激活,提示integrinα5β1-FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK-cofilin可能在體內(nèi)病毒感染過程中也發(fā)揮作用。小鼠靜脈注射ATN-161以降低腦組織integrinα5β1表達(dá)量,隨后滴鼻接種PHEV,利用qRT-PCR、Western blotting、GST-pull down、間接免疫熒光、HE染色等方法檢測(cè)ATN-161在體內(nèi)是否具有抗病毒作用。結(jié)果顯示,小鼠靜脈注射ATN-161后,其發(fā)病時(shí)間延緩、臨床癥狀減輕、體重下降率降低且其生存期顯著延長(zhǎng);HE染色發(fā)現(xiàn),ATN-161治療后,小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞趨于正常,并且在5 dpi時(shí)未出現(xiàn)典型的非化膿性腦炎病理變化;ATN-161可使小鼠腦內(nèi)病毒表達(dá)量顯著降低且FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK-cofilin通路激活情況被抑制。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí),integrinα5β1-FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMKcofilin可促進(jìn)PHEV在體內(nèi)增殖;而且integrinα5β1抑制劑ATN-161在體內(nèi)具有一定的抗病毒作用。綜上所述,本研究首先闡明了PHEV進(jìn)入N2a細(xì)胞期間F-actin骨架重塑的特定機(jī)制,并確定cofilin活性為F-actin骨架重塑和病毒進(jìn)入過程之間的分子開關(guān),為深入解析PHEV誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。另外,integrinα5β1特異性抑制劑ATN-161在體內(nèi)具有一定抗病毒作用,說明cofilin和上游信號(hào)分子可作為治療性抗病毒策略的可行性靶標(biāo),為新型抗病毒藥物的研發(fā)提供理論支撐。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：2770091