【摘要】：新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是嚴(yán)重危害禽養(yǎng)殖業(yè)的重要病原微生物。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),在NDV感染雞的氣管和腺胃中,干擾素和雞干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1(Chicken interferon induced transmembrane protein 1,chIFITM1)顯著上調(diào)表達(dá)。但是chIFITM1能否抑制NDV的復(fù)制及其影響因素,目前仍不清楚。本研究構(gòu)建了chIFITM1的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-HA-chIFITM1,轉(zhuǎn)染LMH和HD11細(xì)胞后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)chIFITM1蛋白均表達(dá)。然而,在LMH細(xì)胞中表達(dá)的chIFITM1并不能抑制NDV的復(fù)制,但在HD11細(xì)胞中表達(dá)的chIFITM1卻能顯著抑制NDV的復(fù)制。chIFITM1是干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,IFITM)家族中的一員,目前研究表明IFITM的抗病毒作用主要與病毒的入侵途徑及IFITM的亞細(xì)胞定位有關(guān),因此我們推測(cè)chIFITM1在LMH和HD11細(xì)胞中抗病毒作用的不同可能與這兩種因素有關(guān)。NDV可以通過直接的膜融合途徑和內(nèi)吞途徑入侵細(xì)胞,膜融合途徑是NDV入侵細(xì)胞的普遍途徑,但NDV入侵不同細(xì)胞時(shí)采用的內(nèi)吞途徑可能存在差異。因此本研究通過檢測(cè)NDV入侵LMH和HD11細(xì)胞的途徑以及chIFITM1的亞細(xì)胞定位分析chIFITM1僅在HD11細(xì)胞中抑制NDV復(fù)制的可能機(jī)制。使用網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑的抑制劑Dynasore,網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑的抑制劑Chlorpromazine,小窩蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑的抑制劑PMA,巨胞飲內(nèi)吞途徑的抑制劑EIPA,吞噬內(nèi)吞途徑的抑制劑Wortmannin,處理細(xì)胞后檢測(cè)其對(duì)NDV吸附、進(jìn)入和復(fù)制的影響。結(jié)果顯示,在LMH和HD11細(xì)胞中,以上5種試劑均不能抑制NDV的吸附,但Dynasore和PMA均能顯著抑制NDV的進(jìn)入和復(fù)制,而Chlorpromazine、EIPA和Wortmannin均不能抑制NDV的進(jìn)入和復(fù)制。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),在病毒感染LMH和HD11細(xì)胞的早期階段,NDV能夠與早期內(nèi)體marker EEA1共定位。使用細(xì)胞內(nèi)體酸化的抑制劑Bafilomycin A1預(yù)處理LMH和HD11細(xì)胞后均能顯著抑制NDV的復(fù)制。上述結(jié)果說明,在LMH和HD11細(xì)胞中,NDV均可通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵細(xì)胞,但是NDV的內(nèi)吞途徑經(jīng)過早期內(nèi)體且依賴內(nèi)體的酸化。上述試驗(yàn)表明,NDV入侵LMH和HD11細(xì)胞的途徑相同,但chIFITM1僅在HD11細(xì)胞中能夠抑制病毒的進(jìn)入和復(fù)制,我們推測(cè)這可能與chIFITM1的亞細(xì)胞定位有關(guān)。通過激光共聚焦試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在LMH細(xì)胞中chIFITM1主要定位在細(xì)胞膜表面;但在HD11細(xì)胞中chIFITM1主要定位在細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)體中,并和EEA1有明顯的共定位。本研究結(jié)果表明,chIFITM1在LMH和HD11細(xì)胞中的抗病毒作用不同是由于chIFITM1的亞細(xì)胞定位不同,即位于HD11細(xì)胞內(nèi)體中的chIFITM1能夠抑制通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入的NDV的復(fù)制,但存在于LMH細(xì)胞膜表面的chIFITM1對(duì)NDV的進(jìn)入和復(fù)制沒有顯著影響。本研究揭示了chIFITM1抑制NDV進(jìn)入細(xì)胞的作用及其可能的原因,為進(jìn)一步探索chIFITM1抑制NDV感染的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

19：DL 2000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：chIFITM1 擴(kuò)增；2：空白對(duì): DL 2000 DNA Marker; 1: Amplicon of chIFITM1; 2: Blank contr圖 3.1 chIFITM1 的 PCR 擴(kuò)增Figure 3.1 Amplification of chIFITM1 by PCRCR 和酶切鑒定GGS-HA-chIFITM1 為模板，使用引物 chIFITM1-F/R 的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像儀中進(jìn)行觀察，發(fā)期的目的條帶大小一致，因此構(gòu)建的質(zhì)粒 pCAGGS-H使用 EcoRⅠ和 XhoⅠ同時(shí)酶切 pCAGGS-HA-chIFITM泳，在紫外凝膠成像儀中進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在約 5 000A 載體的預(yù)期大小一致，另外，在約 342 bp 處有一條期大小一致，因此構(gòu)建的質(zhì)粒 pCAGGS-HA-chIFITM1

圖 3.3 間接免疫熒光反應(yīng)檢測(cè) chIFITM1 的表達(dá)Figure 3.3 Detection of the expression of chIFITM1 by IFAestern blotMH 細(xì)胞和 HD11 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染 pCAGGS-HA-chIFITM1，36 h 后收取細(xì)胞進(jìn)行 W，在近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)中拍照發(fā)現(xiàn)，真核表達(dá)質(zhì)粒 pCAGGS-HA-chIFITM1 在D11 細(xì)胞中均有較深的條帶，這說明 chIFITM1 在這兩種細(xì)胞中均成功表達(dá)（圖 3

圖 3.3 間接免疫熒光反應(yīng)檢測(cè) chIFITM1 的表達(dá)Figure 3.3 Detection of the expression of chIFITM1 by IFA3.2.2 Western blot在 LMH 細(xì)胞和 HD11 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染 pCAGGS-HA-chIFITM1，36 h 后收取細(xì)胞進(jìn)行 Westernblot 試驗(yàn)，在近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)中拍照發(fā)現(xiàn)，真核表達(dá)質(zhì)粒 pCAGGS-HA-chIFITM1 在 LMH細(xì)胞和 HD11 細(xì)胞中均有較深的條帶，這說明 chIFITM1 在這兩種細(xì)胞中均成功表達(dá)（圖 3.4）。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 余輝;胡曉婷;劉新光;陳維春;;RAB4B蛋白研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)藥生物技術(shù);2019年01期

2 吳雙;劉秀梵;王曉泉;朱善元;王安平;王永娟;洪偉鳴;左偉勇;;基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究新城疫病毒的入胞機(jī)制[J];中國家禽;2012年21期

3 杜長征,張志文;受體介導(dǎo)式入胞的分子機(jī)理(2)[J];生物學(xué)通報(bào);2004年12期

4 馬西敬;王耀東;;Rab5a與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[J];福建醫(yī)藥雜志;2008年03期

5 龔愛華;張志堅(jiān);楊勇;孫湘蘭;肖德生;殷凱;;神經(jīng)生長因子對(duì)受體pTrkA在U251細(xì)胞中亞定位的影響[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年06期

6 湯雪明,張蕙心,陳曉群;睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)體的細(xì)胞化學(xué)研究[J];電子顯微學(xué)報(bào);1997年03期

7 趙縝;樊綺詩;;Rab蛋白在囊泡運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)中的作用[J];生命的化學(xué);2009年05期

8 陳曉群,湯雪明;細(xì)胞內(nèi)吞的研究進(jìn)展[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;1994年01期

9 宋春嬌,史忠誠;RAB5A蛋白的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);2003年03期

10 陳香梅;李鈺;;Rab5a研究進(jìn)展[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2006年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前3條

1 劉媛;原婉瓊;劉琪瑤;馬大龍;韓文玲;;CMTM3在B-ALL中的表達(dá)和功能探究[A];第十二屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2017年

2 劉正陽;莫曉寧;馬大龍;韓文玲;;CMTM7影響小鼠B-1a細(xì)胞發(fā)育[A];第十二屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)壁報(bào)交流集[C];2017年

3 劉媛;劉正陽;馬大龍;韓文玲;;CMTM7促進(jìn)EGFR降解的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及其對(duì)Getinib增敏作用的研究[A];第十三屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2018年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 王洪濤;SGEF增強(qiáng)EGFR蛋白穩(wěn)定性的分子機(jī)制及生物學(xué)意義[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2014年

2 王家剛;擬南芥μ1銜接蛋白介導(dǎo)反式高爾基網(wǎng)絡(luò)和早期內(nèi)體上的蛋白分揀[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 汪蕾;NK細(xì)胞通過clathrin途徑回收穿孔素及對(duì)殺傷功能的影響[D];華中科技大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 范振;chIFITM1對(duì)NDV的體外抑制作用研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

2 楊雪姣;CpG-c41對(duì)內(nèi)膜型TLRs的交互干擾及其機(jī)制探究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2770066