【摘要】：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis,RE)是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起的一群病理綜合征,主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤和淋巴組織慢性腫瘤。REV通常與其他病毒混合感染,并易整合到宿主基因組中,再加上感染后的免疫抑制,導(dǎo)致RE的防控工作越來(lái)越困難。本研究旨在通過(guò)對(duì)env蛋白和gp90蛋白免疫原性的比較,從而篩選出免疫原性更好的蛋白,為RE亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。首先,本研究選擇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)REV的囊膜蛋白env進(jìn)行了表達(dá),構(gòu)建了含有多個(gè)Menv表達(dá)盒的重組SMD1168菌株和重組GS115菌株,在搖瓶?jī)?nèi)利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明,重組env蛋白在構(gòu)建的重組畢赤酵母菌株中均能成功表達(dá),在GS115菌株中的表達(dá)量明顯超過(guò)在SMD1168菌株中的表達(dá)量;重組菌株GS115/pAO815-2Menv的表達(dá)量高于GS115/pAO815-4Menv和GS115/pAO815-6Menv的表達(dá)量,說(shuō)明表達(dá)盒數(shù)量的增加對(duì)env蛋白的表達(dá)量沒(méi)有顯著的提升作用。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化,重組菌株GS115/pAO815-2Menv在搖瓶?jī)?nèi)的表達(dá)量可達(dá)到0.5 g/L。為了獲得大量的重組env蛋白和gp90(上清)蛋白,本研究對(duì)兩種蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了一系列的優(yōu)化,并對(duì)發(fā)酵得到的蛋白進(jìn)行純化,將純化前后的蛋白分別置于室溫、4℃和-20℃保存以比較其穩(wěn)定性。結(jié)果表明,重組菌株GS115/pAO815-2Menv在29℃、pH=5.5的條件下發(fā)酵培養(yǎng),env蛋白的表達(dá)量最高,高達(dá)3.5 g/L;重組菌株SMD1168/pPIC9k-gp90在27℃、pH=6.0的條件下發(fā)酵培養(yǎng),gp90(上清)蛋白的表達(dá)量最高,高達(dá)1.1 g/L;可以通過(guò)親和層析的方法得到純度較高的重組env蛋白和gp90(菌體)蛋白,gp90(上清)蛋白通過(guò)30 kD的超濾管進(jìn)行濃縮處理;三種蛋白經(jīng)純化后穩(wěn)定性有所提升,但不顯著,仍存在嚴(yán)重的降解問(wèn)題。通過(guò)動(dòng)物攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn),對(duì)gp90(上清)蛋白、gp90(菌體)蛋白和env蛋白的免疫原性進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,三種蛋白均能產(chǎn)生較高水平的ELISA抗體和中和抗體。同時(shí),相對(duì)于對(duì)照組的病毒載量,gp90(上清)蛋白免疫組的病毒載量降低2.36×10~5倍,gp90(菌體)蛋白免疫組的病毒載量降低6.61×10~3倍,env蛋白免疫組的病毒載量降低6.08×10~3倍。這些結(jié)果表明,三種蛋白均具備良好的免疫原性。本研究成功實(shí)現(xiàn)了env蛋白在畢赤酵母中的表達(dá),并通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)的條件,可獲得大量免疫原性良好的重組蛋白,能有效保護(hù)SPF雞免受REV的感染。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

母表達(dá)系統(tǒng)對(duì) env 蛋白進(jìn)行表達(dá)，并通過(guò)親和層定點(diǎn)無(wú)義突變，突變掉 env 序列中帶有的 BglⅡ和載體 pAO815；第二，利用體外構(gòu)建多表達(dá)盒的方達(dá)質(zhì)粒；第三，將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)第四，通過(guò)搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)，比較各重組菌株 env 于后續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果表明，env 蛋白可以在畢赤達(dá)量明顯高于 SMD1168 中的表達(dá)量，其中，表在搖瓶中的 env 表達(dá)量可達(dá) 0.5 g/L。0901）重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；大腸桿菌 存；畢赤酵母表達(dá)載體 pAO815、畢赤酵母菌株 S

業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒 env 蛋白在畢赤酵母中3 重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 Menv 的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，用 EcoRⅠ分別酶切該膠收產(chǎn)物和 pAO815 載體，37 對(duì)兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并通過(guò) T4 連接酶 16 ℃過(guò)夜連接，連接體系（10 μL） Menv 的酶切產(chǎn)物，1 μL 的 pAO815 載體的酶切產(chǎn)物，1 μL 的 10×Buffer，1 μL 的 T到的重組質(zhì)粒命名為 pAO815-Menv。了體外構(gòu)建含有多個(gè) Menv 表達(dá)盒的重組表達(dá)質(zhì)粒，用 BglⅡ和 BamHⅠ酶切 pAO815整的 Menv 表達(dá)盒：5 AOX1-Menv-3 AOX1(TT)；將 Menv 表達(dá)盒克隆到經(jīng) BamHⅠ5-Menv 中，得到含有兩個(gè) Menv 表達(dá)盒的重組表達(dá)質(zhì)粒 pAO815-2Menv；用 BglⅡ和 pAO815-2Menv，將兩個(gè) Menv 表達(dá)盒同時(shí)插入經(jīng) BamHⅠ線性化的 pAO815-2Menv 中，個(gè) Menv 表達(dá)盒的重組表達(dá)質(zhì)粒 pAO815-4Menv；用同樣的方法獲得含有 6 個(gè) Menv 表達(dá)質(zhì)粒 pAO815-6Menv。將這些重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Top10F 感受態(tài)。

M：DL2000 DNA Marker；1：Menv；2：陰性對(duì)照M：DL2000 DNA Marker；1：Menv；2：Negative control圖 2-3 Menv 基因的擴(kuò)增Fig.2-3 PCR amplification of Menv鑒定env 轉(zhuǎn)化 Top10F 感受態(tài)，小提質(zhì)粒，以 815Eco，可以獲得 1.8 kb 的 Menv 片段（圖 2-4）。用 Ec行單酶切，pAO815 酶切后只有一條 7.7kb 的條帶 7.7 kb 和 1.8 kb（圖 2-5），1.8 kb 的條帶為插入的行測(cè)序，與預(yù)期相符。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2769845