【摘要】：近年來(lái),抗生素耐藥性已經(jīng)成為了一個(gè)危害公共衛(wèi)生和食品安全的全球性問題�？股乜剐曰�(antibiotic resistance genes,ARGs)可以通過水平轉(zhuǎn)移和垂直傳播在動(dòng)物、環(huán)境和人之間循環(huán)�；钋菔袌�(chǎng)作為一個(gè)交易地點(diǎn),大量的動(dòng)物在市場(chǎng)被頻繁的轉(zhuǎn)運(yùn),不僅促進(jìn)了病毒的傳播,也促進(jìn)了耐藥基因和耐藥菌的傳播。但ARGs在我國(guó)活禽市場(chǎng)環(huán)境中的生態(tài)學(xué)分布規(guī)律目前尚不清楚,因此有必要開展典型活禽市場(chǎng)環(huán)境中ARGs的多樣性及分布特征和活禽腸道菌群多樣性研究。本文針對(duì)這個(gè)問題開展研究,選取我國(guó)活禽市場(chǎng)作為研究對(duì)象,通過大規(guī)模的樣本采集調(diào)查,利用宏基因組學(xué)測(cè)序深入研究ARGs在活禽市場(chǎng)的污染特征和活禽腸道微生物的多樣性,并與豬、人和小鼠的參考基因集進(jìn)行比較分析,主要內(nèi)容如下:首先,對(duì)長(zhǎng)期進(jìn)行流感病毒監(jiān)測(cè)的活禽市場(chǎng)進(jìn)行采集樣本調(diào)查研究。選取我國(guó)18個(gè)省和自治區(qū)中的26個(gè)活禽市場(chǎng),采集多種活禽的新鮮糞便,通過非培養(yǎng)的方法直接提取樣本中的總DNA,并利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。通過對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行全面生物信息學(xué)分析,共有102只雞的腸道菌群及功能多樣性。結(jié)果顯示,雞的腸道菌群中90.71%以上是細(xì)菌,在各分類水平上分屬于16個(gè)門、30個(gè)綱、48個(gè)目、110個(gè)科、213個(gè)屬和433個(gè)種。通過與已知的豬、人和小鼠腸道參考基因集比較,發(fā)現(xiàn)四組的腸道菌群基因集差異巨大,兩兩之間有一定的重疊,但四者共有的基因占各自基因集的比例較低。在基因水平,雞的腸道微生物基因比人和小鼠具有較高的α多樣性,但低于豬的菌群基因α多樣性;在KO水平,雞比豬和人的微生物具有較低的α多樣性。相對(duì)而言,雞、豬、人和小鼠的腸道微生物在功能層面上展現(xiàn)了較高的相似性;功能水平上,雞、豬、人和小鼠的KO功能有很大比例的重疊(4316個(gè)KO,占總KO的50.1%)。其次,對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行耐藥基因注釋,結(jié)果表明,ARGs廣泛分布于所有的活禽市場(chǎng),共有235種耐藥基因型,而且南方市場(chǎng)中檢測(cè)到的ARGs數(shù)量顯著多于北方。在測(cè)序的130份活禽樣本中,共有71份樣本攜帶有多粘菌素抗性基因mcr-1,利用PCR技術(shù)對(duì)活禽市場(chǎng)中mcr-1的分布進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)mcr-1基因有很高的陽(yáng)性率(59.63%)。此外,在我們的樣本中還發(fā)現(xiàn)了mcr-3 mcr-4、mcr-5和NDM-1等高風(fēng)險(xiǎn)基因。最后,通過比較分析活禽、豬、人和小鼠的參考基因集,結(jié)果表明,活禽與豬、人和小鼠共享很多種ARGs,而且有43種ARGs在4組樣本中是共有的,總體而言,ARGs在4組樣本中的種類分布差異比較大,活禽中ARGs的數(shù)量和豐度均顯著高于豬、小鼠和人,值得注意的是,四環(huán)素類耐藥基因在四組中均是最豐富的。綜上所述,攜帶各種ARGs的活禽被運(yùn)到活禽市場(chǎng)進(jìn)行頻繁交易;多粘菌素耐藥基因mcr-1在活禽市場(chǎng)樣本中有很高的陽(yáng)性率;不同活禽之間的ARGs有很高的共享率,提示ARGs有可能是由于在活禽市場(chǎng)中交叉?zhèn)鞑?dǎo)致;有多種ARGs在人、豬、小鼠和活禽的腸道微生物中也是共享的;但在基因水平具有較少的相同基因,在功能水平具有更多相同的代謝通路。本文通過宏基因組學(xué)方法,從深度測(cè)序的角度揭示了 ARGs和腸道微生物在不同物種和地區(qū)之間的差異特征,對(duì)公共衛(wèi)生的防控及食品安全的評(píng)估具有重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S859.796
【圖文】：

揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)及其在細(xì)菌耐藥方面研究的應(yīng)用逡逑大多數(shù)的環(huán)境微生物是無(wú)法通過純培養(yǎng)的方法得到，為研究耐藥況及生態(tài)學(xué)分布規(guī)律，需要采用不需要培養(yǎng)的宏基因組學(xué)方法。接克隆的方法對(duì)環(huán)境微生物總ＤＮＡ進(jìn)行整體研究，是由Ｈａｎｄｅｌ提出來(lái)，這種方法不需要分離培養(yǎng)微生物，可以克服傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法局限性，通過構(gòu)建文庫(kù)、高通量測(cè)序，篩選已知和未知的耐藥基資源［４２］，還可以對(duì)環(huán)境樣本中的活性物質(zhì)進(jìn)行篩選［４３４５］。目前宏列分析和功能篩選兩個(gè)方向（圖１）。序列分析主要是針對(duì)環(huán)境中，分析該環(huán)境中微生物的組成和相關(guān)功能。對(duì)環(huán)境中的耐藥基因耐藥機(jī)制，為控制其傳播和研發(fā)新的抗生素提供指導(dǎo)。通過這兩方腸道微生物的結(jié)構(gòu)和功能基因組，從而為深入探索腸道菌群的代。逡逑

主要相關(guān)試劑逡逑提取試劑盒：德國(guó)Ｓｔｒａｔｅｃ邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ＧｍｂＨ。逡逑Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ邋ＤＮＡ邋Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｋｉｔ。逡逑Ｎａｍｐ邋Ｂａｃｔｅｒｉａ邋ＤＮＡ邋Ｋｉｔ邋0逡逑試劑逡逑稱�。保埃埃恚斓母视秃停保埃埃恚斓恼麴s水混勻，１２１°Ｃ濕熱滅菌３０ｍｉｎ。逡逑ＣａＣｈ：稱�。欤欤欤绲模茫幔茫璺湃耄保埃埃恚鞜�，加入９０ｍｌ的蒸餾水定容到ｌ00ｍｌ，１２１°Ｃ濕熱滅菌３０ｍｉｎ。逡逑ｆｆｅｒ：邋２ＭＴｒｉｓ－醋酸，ｌＯＯＭｍＥＤＴＡ，ＰＨ邋８．５，室溫保存。逡逑凝膠：稱�。埃福绛傊怯茫保埃埃恚斓模欤裕粒庞梦⒉t中加熱充分溶解事先洗干凈的制膠槽，然后插入合適的梳子，待其凝固后使用。逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｓｐａｒｓｅ邋ｃｕｒｖｅ逡逑和小鼠腸道微生物中基因的異同逡逑小鼠腸道微生物中僅有很少一部分基因（９０３７個(gè)）２％邋（豬）、０．０９％邋（人）和０．３６％邋（小鼠）。基因在的重疊（禽對(duì)豬，９４３１５個(gè)基因；禽對(duì)人，９０８４８３個(gè)１－３）。逡逑２３＆＊８４５邐６３９９９７６逡逑資ＳＴ：．邐２１２１逡逑８９０５６邐３Ｓ？７Ｓ逡逑ＷＩ０邐１．１１７逡逑８０２９３２１邐７３９９２２６逡逑９０３７逡逑７３５０７７ｒ邋Ｖ＊邐７＞８１逡逑４／Ｍ６邐２１３；＞逡逑Ｂ３００８Ｓ逡逑

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本文編號(hào)：2768231