發(fā)布時(shí)間：2020-07-23 18:55

【摘要】：羊傳染性膿皰病是由傳染性膿皰病毒(Orf virus,ORFV)感染引起以綿羊、山羊?yàn)橹鞯囊环N急性、高度接觸性傳染病。以在患羊口唇等部位的皮膚或黏膜形成紅斑、膿皰等病變?yōu)橹饕卣鳌Ｍ瑫r(shí),它也是一種重要的人獸共患病。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),宿主因子親環(huán)蛋白B(Cyclophilin B,Cyp B)能夠促進(jìn)ORFV的復(fù)制增殖。然而,Cyp B在ORFV侵染過(guò)程中發(fā)揮怎樣的生物學(xué)功能,而ORFV又是如何利用Cyp B促進(jìn)其復(fù)制增殖并完成侵染的過(guò)程尚不明確。因此,本研究對(duì)Cyp B在ORFV侵染過(guò)程中潛在的生物學(xué)功能進(jìn)行探討分析,并利用免疫共沉淀技術(shù)對(duì)與Cyp B互作的病毒蛋白或蛋白質(zhì)分子群進(jìn)行篩選。為明確Cyp B在ORFV侵染過(guò)程中潛在的生物學(xué)功能,首先利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)Cyp B在感染前后宿主細(xì)胞中的定位分布情況進(jìn)行檢測(cè);同時(shí)制作細(xì)胞超薄切片,利用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化以及Cyp B蛋白的定位分布,結(jié)果顯示,Cyp B主要分布在MDBK細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。之后,應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針ER-Tracker Red進(jìn)行熒光標(biāo)記,利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察Cyp B在亞細(xì)胞水平上的定位分布,結(jié)果顯示,在ORFV感染的宿主細(xì)胞中,Cyp B與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在明顯的共定位現(xiàn)象,該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Cyp B主要定位分布于MDBK細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。利用特異性抑制劑環(huán)孢菌素A(Cs A)改變Cyp B的順?lè)串悩?gòu)酶活性,探討其活性改變對(duì)ORFV感染宿主細(xì)胞能力的影響。利用Western-blot檢測(cè)在ORFV早期感染MDBK細(xì)胞中加入不同濃度Cs A對(duì)Cyp B表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,隨著Cs A濃度的增加,Cyp B的表達(dá)量逐漸下降,該結(jié)果表明Cs A能夠抑制Cyp B的表達(dá)。利用Real-time PCR檢測(cè)加入不同濃度Cs A對(duì)病毒復(fù)制的影響,結(jié)果顯示,在低劑量藥物濃度范圍內(nèi),Cs A不僅能夠抑制Cyp B的表達(dá),而且同時(shí)抑制ORFV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制增殖。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Cyp B是ORFV侵染過(guò)程中的重要輔助因子,能夠促進(jìn)ORFV復(fù)制。然而,ORFV是如何利用Cyp B促進(jìn)其復(fù)制增殖并完成侵染的過(guò)程尚不清楚。因此,本研究利用免疫共沉淀技術(shù)篩選與Cyp B互作的蛋白。免疫共沉淀產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-blot的分析結(jié)果顯示,在大小約為25 k D處可見(jiàn)有明顯的差異條帶。切下該差異蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析,將獲得的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Mascot軟件中的串級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索功能(MS/MS Ions Search)進(jìn)行搜索鑒定,初步篩選獲得6個(gè)可能與Cyp B相互作用的病毒相關(guān)蛋白。上述研究結(jié)果將不僅為從病毒與宿主互作角度闡明ORFV的致病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),也為利用Cyp B途徑阻斷ORFV的感染提供有價(jià)值的資料。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【圖文】：

第二篇 研究?jī)?nèi)容 第 1 章 CypB 在 ORFV 早期感染宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位1.3 結(jié)果1.3.1 免疫熒光標(biāo)記觀察結(jié)果正常 MDBK 細(xì)胞接種 ORFV 4h 后制成細(xì)胞爬片，同時(shí)制作未接毒的正常MDBK 細(xì)胞爬片作為對(duì)照。應(yīng)用間接免疫熒光染色法，利用激光共聚焦顯微鏡初步觀察 CypB 蛋白在 ORFV 早期感染 MDBK 細(xì)胞前后的定位分布情況。結(jié)果顯示無(wú)論病毒感染前（圖 1.1）后（圖 1.2）在 MDBK 細(xì)胞的胞漿中均可見(jiàn)較亮的綠色熒光，部分細(xì)胞核位置出現(xiàn)較暗綠色熒光。

MDBK 細(xì)胞爬片作為對(duì)照。應(yīng)用間接免疫熒光染色法，利用激光共聚焦顯微鏡初步觀察 CypB 蛋白在 ORFV 早期感染 MDBK 細(xì)胞前后的定位分布情況。結(jié)果顯示無(wú)論病毒感染前（圖 1.1）后（圖 1.2）在 MDBK 細(xì)胞的胞漿中均可見(jiàn)較亮的綠色熒光，部分細(xì)胞核位置出現(xiàn)較暗綠色熒光。圖 1.1 正常 MDBK 細(xì)胞內(nèi) CypB 的分布定位（標(biāo)尺: 10μm）A: 細(xì)胞核熒光顯色 B: CypB 蛋白熒光顯色 C: 合并顯色Fig.1.1 Fluorescent photos of normal MDBK cells (Scale bar = 10μm)A, Fluorescent photos of cellular nucleus; B, Fluorescent photos of CypB; C, Merge

第二篇 研究?jī)?nèi)容 第 1 章 CypB 在 ORFV 早期感染宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位早期感染 MDBK 細(xì)胞前后的定位分布情況。結(jié)果顯示病毒感染前（圖 1.3 箭頭所示）或病毒感染后（圖 1.4 箭頭所示）在 MDBK 細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上均可見(jiàn)較多膠體金顆粒。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號(hào)：2767710