【摘要】：中和抗體能夠與病毒表面的抗原結(jié)合,從而阻止病毒吸附靶細(xì)胞受體,防止病毒侵入細(xì)胞,在抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。因此,中和抗體是一種具有很好應(yīng)用前景的抗病毒治療制劑。但是,采用小鼠單克隆抗體技術(shù)制備的抗病毒中和抗體對(duì)于人或畜禽等動(dòng)物存在異源性等特性,導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到限制。近年來(lái),隨著抗體制備技術(shù)的發(fā)展,制備人源或動(dòng)物源的中和抗體成為研究熱點(diǎn)。目前,針對(duì)人類免疫缺陷病毒、流感病毒、埃博拉病毒、登革熱病毒等多種病毒的全人源中和抗體開發(fā)取得了顯著進(jìn)展,而且還發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)可能存在具有抗病毒中和作用的天然中和抗體。相對(duì)于人源中和抗體研究,豬等動(dòng)物源中和抗體的開發(fā)尚處于起步階段。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的妊娠母豬繁殖障礙、仔豬嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)癥狀和生長(zhǎng)遲緩等臨床表現(xiàn)的病毒性傳染病。PRRSV感染或免疫能誘發(fā)很強(qiáng)的體液免疫反應(yīng),一般于感染后7~9 d可檢測(cè)到特異性抗體,但這些抗體對(duì)體內(nèi)、外的病毒都沒有中和能力甚至?xí)鰪?qiáng)感染,而有效的中和抗體一般出現(xiàn)于28 d以后。由于中和抗體產(chǎn)生的時(shí)間晚、水平低,使該病的防治十分困難。為深入研究豬對(duì)PRRSV的抗體反應(yīng),本研究利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了豬源抗體庫(kù),并從中篩選到具有中和能力的抗體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)篩選到的中和抗體為多反應(yīng)性抗體,主要結(jié)合細(xì)胞蛋白KRT8(Keratin 8)和MYH9(Nonmuscle myosin heavy chain II-A)。具體研究?jī)?nèi)容如下:1.豬源天然抗體庫(kù)的構(gòu)建與抗PRRSV抗體的篩選分離PRRSV抗原、抗體陰性豬的PBMCs(Peripheral Blood Mononuclear Cells),提取mRNA,利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到抗體重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)基因,通過overlap PCR將VH、VL用一條柔性多肽基因組裝成scFv(single-chain antibody)片段。噬粒pComb3XSS與scFv片段經(jīng)Sfi I酶切、回收、連接、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,獲得庫(kù)容為1.5×10~8的初級(jí)庫(kù),經(jīng)鑒定插入片段大小的正確率為80%。通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)VH序列的相似度介于63.3%~92.5%,未發(fā)現(xiàn)相同序列,說(shuō)明抗體庫(kù)的多樣性好。與IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)天然庫(kù)VH基因家族的分布符合文獻(xiàn)報(bào)道的最多的3個(gè)基因家族占比40%,最多的6個(gè)基因家族占比70%的規(guī)律,而且天然庫(kù)的VH基因分布于13個(gè)不同的基因家族,進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)建的天然庫(kù)具有很好的多樣性。加入輔助噬菌體超感染獲得重組噬菌體抗體庫(kù),用純化的PRRSV病毒粒子進(jìn)行篩選,獲得4株噬菌體抗體N-28、N-36、N-48、N-67。將獲得的抗體基因連接至pET-22b表達(dá)載體,經(jīng)鑒定重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。對(duì)包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性后,測(cè)定了4株抗體中和PRRSV的能力,發(fā)現(xiàn)其中N-28、N-67具有一定的中和PRRSV的能力。2.豬源PRRSV免疫抗體庫(kù)的構(gòu)建與抗PRRSV抗體的篩選為篩選具有廣譜抗PRRSV的中和抗體,首先用PRRSV商品化弱毒活疫苗免疫30日齡仔豬,然后用高致病性PRRSV毒株(WUH3株)、兩種美國(guó)流行毒株(VR2385、VR2549)、國(guó)內(nèi)分離的流行毒株(NADC30L)對(duì)仔豬進(jìn)行感染。經(jīng)過8次免疫/感染后,實(shí)驗(yàn)豬體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)PRRSV WUH3株、VR2385株、VR2549株和NADC30L株的高滴度中和抗體,中和效價(jià)介于1∶63.5~1∶858.7之間。分離高免疫豬的PBMCs,擴(kuò)增抗體基因,經(jīng)過多次電轉(zhuǎn)獲得庫(kù)容為2×10~7的初級(jí)庫(kù),經(jīng)鑒定插入片段大小的正確率為89.4%。通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)VH序列的相似度介于70.3%~93.5%,未發(fā)現(xiàn)相同序列,說(shuō)明免疫抗體庫(kù)的多樣性好;VH基因家族則由天然庫(kù)的13個(gè)下降為6個(gè),說(shuō)明經(jīng)過多次免疫/感染后試驗(yàn)豬的抗體基因使用率發(fā)生了明顯的變化。用純化的PRRSV病毒粒子對(duì)構(gòu)建的抗體庫(kù)進(jìn)行富集、篩選,最終獲得3株噬菌體抗體I-2154、I-1320、I-141。將抗體基因連接至原核表達(dá)載體pET-22b中,表達(dá)純化后測(cè)定了3株抗體對(duì)PRRSV WUH3株、VR2549株、NADC30L株的中和能力,結(jié)果表明3株抗體對(duì)3株病毒均有一定的中和作用,其中I-141的中和效果最好。3株病毒對(duì)抗體的敏感度也不相同,其中NADC30L對(duì)I-141最為敏感。進(jìn)一步分析了I-141對(duì)NADC30L的抑制機(jī)制,發(fā)現(xiàn)I-141并不影響病毒的吸附而是抑制了病毒的侵入。3.scFv結(jié)合蛋白的質(zhì)譜鑒定與功能研究首先用生物素標(biāo)記的N-28、I-141分別與感染或不感染PRRSV的MARC-145細(xì)胞裂解液孵育,用鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠分離與scFv結(jié)合的蛋白,然后對(duì)分離的蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果檢索PRRSV WUH3編碼蛋白,在2個(gè)接毒組中均未能鑒定到病毒蛋白;對(duì)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組鑒定到的蛋白分析發(fā)現(xiàn)有30種蛋白在4個(gè)實(shí)驗(yàn)組均能被鑒定到,提示N-28、I-141可能為多反應(yīng)性抗體。為了確認(rèn)這兩株scFv的多反應(yīng)性,選擇了KRT8、MYH9這兩種已知在病毒感染細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用的蛋白作為研究對(duì)象,通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)N-28、I-141能與KRT8、MYH9發(fā)生互作,確認(rèn)了這兩種scFv的多反應(yīng)性。然后在PK-15~(CD163)細(xì)胞中干擾或超表達(dá)這兩種蛋白,證實(shí)這兩種蛋白參與了PRRSV的感染,并且在PRRSV侵入細(xì)胞過程中這兩種蛋白的表達(dá)量上調(diào)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4
【圖文】：

盡管抗體分子有不同的類和亞類，是一種極不均一的分子群，而且能結(jié)合不同的抗原，但所有的抗體分子都有著相似的基本結(jié)構(gòu)，都由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成，輕、重鏈內(nèi)和鏈間通過二硫鍵連接(Edelman 1959)。輕鏈的分子量約為 25kD，重鏈的分子量在 50kD～70kD 之間(Edelman et al 1969)。輕鏈有兩種類型：kappa（ ）鏈和 lambda（ ）鏈，它們構(gòu)成抗體分子的比例在不同物種間是不同的，小鼠抗體為 20：1，人抗體約為 2：1，而豬抗體接近 1：1(Butler et al 2005)。重鏈有5 種類型： 、 、 、 、 ，分別決定了抗體的 5 中類別：IgM、IgD、IgG、IgA、IgE(Maand O'Kennedy 2015)。其中有的類別還有亞類，如鼠 IgG 可分為 4 個(gè)亞類：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，人的IgG也可分為4個(gè)亞類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4(Schroeder et al 2010)。輕、重鏈的氨基端約 110 個(gè)氨基酸變異很大被稱為可變區(qū)（variable region，V），其余部分變化不大為恒定區(qū)（constant region，C）(Schroeder et al 2010)。可變區(qū)與特異性識(shí)別抗原有關(guān)，而恒定區(qū)則參與免疫應(yīng)答具有許多生物學(xué)效應(yīng)。同一物種、圖 1-1 抗體分子結(jié)構(gòu) (Roitt I et al 2010)Fig. 1-1 Antibody molecules structure

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆博士研究生學(xué)位論文Lunney et al 2016)，位于編碼區(qū) 5 端的 ORF1a 和 ORF1b 先翻譯出兩個(gè)聚蛋白前體pp1a 和pp1ab，隨后經(jīng)酶解得到 16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白：nsp1 ，nspnsp7 ，nsp7 ，nsp8-12；以及新發(fā)現(xiàn)的 nsp2TF，nsp2N(Fang et al 2012, Li)。與其它的動(dòng)脈炎病毒一樣，PRRSV 通過不連續(xù)轉(zhuǎn)錄機(jī)制合成 6 個(gè)亞基RNAs（sub genome RNA，sg mRNAs），sg mRNAs 具有相同的 5 端先導(dǎo)3 末端。PRRSV 的 sg mRNAs 編碼病毒的 8 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白；其中 GP2a、GP3P5 為與囊膜有關(guān)的糖基化蛋白，E、ORF5a、M 為非糖基化蛋白，N 為核圖 1-3）(Snijder et al 2013, Kappes and Faaberg 2015)。

RRSV 抗原、抗體陰性的斷奶仔豬，為英山地方品種豬，購(gòu)自、毒株、疫苗與菌株腎傳代細(xì)胞（MARC-145）為本實(shí)驗(yàn)室保存。163細(xì)胞為西北農(nóng)林科技大學(xué)周恩民教授惠贈(zèng)。 WUH3 株、NADC30L 株為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，PRRSV V自 ATCC。PRRSV 商品化弱毒疫苗 Ingelval PRRS MLV、JXA1病預(yù)防控制中心。 DH5 、BL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌 XL1-blue 由物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室彭貴清教授惠贈(zèng)。與質(zhì)粒T 克隆載體購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）公司。omb3XSS，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室彭貴。載體 pET-22b、真核表達(dá)載體 pCAGGS-Flag 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

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