發(fā)布時間：2020-07-23 06:03

【摘要】：犬瘟熱病毒與犬細小病毒可以引起犬科、鼬科、大熊貓科等動物的烈性傳染疾病,引起動物的死亡率可高達80%,給我國寵物飼養(yǎng)業(yè)、皮毛動物飼養(yǎng)業(yè)、野生動物保護領(lǐng)域均帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。目前國內(nèi)外主要使用犬瘟熱與犬細小病毒的弱毒疫苗對疾病進行防控,但該種類疫苗存在一些不足之處,例如生產(chǎn)成本比較高,弱毒疫苗具有毒力返強的隱患,面對不同的病毒變異株有其局限性等。本研究旨在構(gòu)建一款高效安全低成本的新型疫苗。我們通過將犬瘟熱與犬細小病毒的抗原基因插入到腺相關(guān)病毒(Adeno associated virus,AAV)基因組中,制備成可預防犬瘟熱與犬細小疾病的腺相關(guān)病毒重組疫苗。本課題首先選擇犬瘟熱病毒的血凝蛋白基因、融合蛋白基因和犬細小病毒的衣殼蛋白基因作為抗原基因,并分別插入到腺相關(guān)病毒基因組中。再通過腺相關(guān)病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)獲得攜帶各抗原基因的重組腺相關(guān)病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)。經(jīng)病毒滴度檢測與外源蛋白表達檢測后,將攜帶有犬瘟熱與犬細小病毒抗原基因的rAAV混合,通過肌肉注射免疫6周齡的Balb/c小鼠,同時以英特威犬二聯(lián)疫苗作為陽性對照,以rAAV-GFP病毒作為陰性對照。在首次免疫實驗中,按照英特威犬二聯(lián)疫苗的免疫程序免疫,即對小鼠進行三次免疫,每次免疫間隔14 d。免疫程序結(jié)束后每隔14 d對小鼠進行采血與中和抗體的檢測。我們得到了良好的實驗結(jié)果,之后為了進一步驗證rAAV疫苗的高效性,按照與三次免疫實驗相同的免疫途徑與免疫劑量對實驗小鼠進行一次免疫實驗,免疫后繼續(xù)監(jiān)測中和抗體水平。三次免疫結(jié)果顯示rAAV疫苗可以使小鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體。在免疫后所有時間點中rAAV疫苗使小鼠產(chǎn)生的抗犬瘟熱病毒中和抗體效價均高于陽性對照,最高時中和抗體效價大于1:500,是陽性對照的4倍。但在免疫后的所有時間點中,rAAV疫苗使小鼠產(chǎn)生的抗犬細小病毒中和抗體效價均與陽性對照接近,中和抗體效價均在1:100到1:200之間,一般認為當中和抗體效價大于1:100時機體便可以免受強毒的攻擊。一次免疫結(jié)果顯示rAAV疫苗依然可以使小鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體。在免疫后第6周rAAV疫苗使小鼠產(chǎn)生的抗犬瘟熱病毒中和抗體效價超過1:100,然而陽性對照產(chǎn)生的抗犬瘟熱病毒中和抗體效價始終小于1:100,理論上我們認為陽性對照免疫失敗,在免疫后第8周rAAV疫苗與陽性對照使小鼠產(chǎn)生的抗犬細小病毒中和抗體效價均超過1:100。在此次免疫實驗中顯示,rAAV疫苗僅需要對動物進行一次免疫,理論上就可以達到對動物的有效免疫。本研究的結(jié)果表明:rAAV疫苗可以激發(fā)小鼠的免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生高水平的中和抗體;rAAV疫苗僅需對動物進行一次免疫在理論上就可以達到對動物的有效免疫;rAAV疫苗針對于犬瘟熱病毒和犬細小病毒產(chǎn)生的免疫效果不平衡,針對于犬瘟熱病毒的免疫效果強于針對犬細小病毒的免疫效果,這種現(xiàn)象可能是由抗原的選擇、rAAV病毒混合的比例與滴度等原因造成的,可在后續(xù)工作中繼續(xù)摸索病毒配比條件以更好的平衡針對兩種病毒的免疫效果。綜上所述攜帶有犬瘟熱與犬細小病毒抗原基因的腺相關(guān)病毒重組疫苗具有安全高效、縮短免疫周期、成本低廉等優(yōu)勢,有望成為有效防控犬瘟熱與犬細小疾病的新型疫苗。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4
【圖文】：

1-1 犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)模式圖（Fuxiao Liu et al 201Structure of Canine Distemper Virus（Fuxiao Liu et的診斷

圖 1-3 rAAV 包裝系統(tǒng)Fig. 1-3 rAAV Packaging System的應用型病毒，現(xiàn)階段沒有 AAV 導致人類疾病胞內(nèi)部穩(wěn)定表達外源基因，并且 AAV 相對和，不同血清型的 AAV 更擴大了 AAV 的來 AAV 在基因治療領(lǐng)域和基礎(chǔ)研究領(lǐng)4）。相關(guān)病毒首次應用于治療囊性纖維化的臨，歐洲批準了基因療法藥物 Glybera，藥物關(guān)病毒，通過注射藥物入患者的腿部肌肉er 2012）；2017 年 10 月，以 AAV 為載體

elper（圖 3-2）及 pAAV-D華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學實驗室保存。室保存；Vero 細胞系和 V驗室趙凌教授課題組友情提點實驗室張安定教授課題組11 株）購買于齊魯動物保健院。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 薛向紅;胡博;趙建軍;劉昊;徐淑娟;閆喜軍;;犬瘟熱疫苗研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2015年10期

2 張海燕;李建波;張斌愷;葉妍琳;王廣龍;肖嘯;;犬瘟熱臨床表現(xiàn)與診治要點[J];中獸醫(yī)學雜志;2014年11期

3 徐鈺;劉劍郁;解林紅;彭鵬;;犬細小病毒診斷與防制研究進展[J];四川動物;2013年03期

4 馬秀玲;;犬瘟熱與犬細小病毒病的鑒別診斷與防治[J];中獸醫(yī)學雜志;2012年03期

5 徐進;孫世琪;曹隨忠;孫德惠;郭慧琛;;犬細小病毒病基因工程疫苗的研究進展[J];中國獸醫(yī)科學;2012年05期

6 趙麗琴;席斌;彭華松;;腺相關(guān)病毒(AAV)載體研究進展[J];生物技術(shù)進展;2012年02期

7 張仁舟;楊松濤;馮昊;崔萇盛;夏咸柱;;中國國內(nèi)首次檢測到犬細小病毒CPV-2c[J];中國病原生物學雜志;2010年04期

8 牛學鋒;劉曉慧;孫招金;施赫赫;陳晶;江飆;孫京臣;郭霄峰;;表達犬細小病毒VP2蛋白的嵌合狂犬病病毒生物學特性的研究[J];病毒學報;2009年05期

9 王國強;;犬細小病毒[J];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技;2008年06期

10 高凱;王軍志;;不同血清型腺相關(guān)病毒載體組織表達差異的研究進展[J];中國腫瘤生物治療雜志;2007年04期

相關(guān)博士學位論文 前2條

1 馮娜;大熊貓犬瘟熱流行病學調(diào)查與實驗免疫研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2017年

2 趙建軍;犬瘟熱病毒對毛皮動物致病性及變異株致病性增強機制的初步研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2016年

相關(guān)碩士學位論文 前2條

1 周云朵;犬細小病毒的分離鑒定與生物學特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2011年

2 許云華;表達GPV VP3和CPV VP2結(jié)構(gòu)蛋白重組乳酸乳球菌的構(gòu)建[D];揚州大學;2008年

本文編號：2766956