【摘要】：H7N9亞型禽流感(Avian Influenza,AI)自2013年在我國(guó)長(zhǎng)三角地區(qū)被發(fā)現(xiàn)以來(lái),給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)病毒基因組的遺傳演化分析和致病性研究顯示,部分低致病性H7N9亞型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)的血凝素(HA)抗原發(fā)生了變化,已由對(duì)家禽無(wú)致病性或低致病性衍化為高致病性。此外,有文獻(xiàn)報(bào)道指出H7N9亞型AIV能夠感染人,使人出現(xiàn)嚴(yán)重的下呼吸道感染癥狀,對(duì)人類公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。H7N9亞型AIV通過(guò)HA吸附到易感細(xì)胞的受體,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。感染的機(jī)體可以產(chǎn)生血凝抑制(HI)抗體。當(dāng)前,單克隆抗體以其高度均質(zhì)性及特異性強(qiáng)等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于疾病的快速臨床診斷,因此,研制H7N9亞型AIV HA特異性單克隆抗體具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究以SPF雞胚繁殖低致病性H7N9亞型AIV,加入終濃度為0.1%的甲醛溶液滅活雞胚尿囊液,再通過(guò)超速離心去除雜蛋白,得到初步純化的病毒。以初步純化的滅活病毒為免疫抗原接種BALB/c小鼠,每只小鼠的每次免疫劑量為50 g病毒蛋白,共進(jìn)行4次免疫。首次免疫用等體積的弗氏完全佐劑與病毒蛋白混合乳化后進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射,后續(xù)免疫均用等體積的弗氏不完全佐劑與病毒蛋白混合乳化進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。經(jīng)過(guò)4次免疫后小鼠血清間接ELISA抗體效價(jià)達(dá)到1:10000以上。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合。融合后通過(guò)間接ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行初步篩選,共得到166個(gè)陽(yáng)性孔。為了獲得針對(duì)H7N9亞型AIV HA的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株,又對(duì)上述陽(yáng)性孔采用HI試驗(yàn)作進(jìn)一步篩選,HI陽(yáng)性的克隆用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。經(jīng)過(guò)2次篩選和亞克隆,最終獲得14株能針對(duì)H7N9亞型AIV HA的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株,命名為 2A4、2A8、2A10、4D1、4G2、5A6、5B8、5D1、5F1、6A7、6D1、6F2、6G2 和6H8。選取HI效價(jià)大于4log2的7株雜交瘤細(xì)胞株(2A10、4G2、5A6、6A7、6D1、6F2和6G2)制備小鼠單抗腹水,并鑒定單抗亞類,結(jié)果顯示,7株單抗中有4株(2A10、6A7、6F2和6G2)為IgM,3株(4G2、5A6和6D1)為IgGl。將三株分泌IgG的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行連續(xù)傳代以檢測(cè)其穩(wěn)定性,結(jié)果顯示,連續(xù)傳代20次細(xì)胞上清HI效價(jià)未發(fā)生明顯變化,說(shuō)明3株雜交瘤均具有良好的穩(wěn)定性。將三株IgG單抗腹水用Protein G親和層析介質(zhì)進(jìn)行純化后通過(guò)HI試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、免疫組織細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)和中和試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。HI試驗(yàn)結(jié)果顯示,3株單抗腹水純化后血凝效價(jià)均大于10 log2;3株IgG亞類的單抗4G2、5A6和6D1均只與H7N9亞型AIV發(fā)生特異性HI反應(yīng),而不與H5亞型AIV、H9亞型AIV和雞新城疫病毒(NDV)發(fā)生交叉反應(yīng);3株單抗中,4G2和5A6具有良好的廣譜性,與鑒定的12株H7N9亞型AIV均能發(fā)生反應(yīng),而6D1株僅能跟其中10株病毒發(fā)生反應(yīng)。間接免疫熒光試驗(yàn)中,3株單抗均能與H7N9亞型AIV感染的CEF細(xì)胞反應(yīng),熒光顯微鏡下能觀察到綠色熒光。細(xì)胞免疫組化試驗(yàn)中,3株單抗均可在H7N9亞型AIV感染的CEF細(xì)胞中檢測(cè)到AIV,顯微鏡下觀察呈棕黃色。雞胚中和試驗(yàn)中,3株單抗均可與低致病性H7N9亞型AIV反應(yīng),導(dǎo)致病毒喪失感染雞胚的能力;5A6對(duì)低致病性H7N9亞型AIV的半數(shù)保護(hù)量(PD50)為10-3.42,4G2的PD50為10-282,6D1的PD50為10-2.91,具有良好的中和特性。本研究成功篩選了具有較高特異性的H7N9亞型AIV HA特異性的單克隆抗體,為后期建立H7N9亞型AIV血清學(xué)檢測(cè)方法及深入研究H7N9亞型AIVHA抗原結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4
【圖文】：

２禽流感病毒的基本特征逡逑ＡＩＶ屬于正黏病毒科，是Ａ型流感病毒，它的基本特征主要為球狀、直徑８０－１２０ｎｍ、逡逑有囊膜和其內(nèi)部為螺旋形的核衣殼（如圖２－１所示）［１Ｍ２］。它由８?jìng)€(gè)節(jié)段的負(fù)股單鏈ＲＮＡ逡逑組成。８?jìng)€(gè)基因節(jié)段分別為ＨＡ、ＮＡ、ＮＳ、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＰＢ１和ＰＢ２，共編碼１２種病毒逡逑蛋白，包括血凝素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）、神經(jīng)氨酸酶（ｎｅｕｒａｍｉｄｉｎａｓｅ，邋ＮＡ）、核蛋白（ＮＰ）逡逑和基質(zhì)蛋白（Ｍｌ、Ｍ２）等（如圖２－２所示）［｜１’１３］。逡逑１邋Ｉ逡逑ｔｅｌ逡逑圖２－１禽流感病毒電鏡圖片｜Ｕ］逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋Ｆｉｇｕｒｅ邋ｏｆ邋Ａｖｉａｎ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋ｖｉｒｕｓｅｓ逡逑流感病毒７０％以上組分都由蛋白質(zhì)組成，以磷脂為主的脂質(zhì)約占２０％，邋ＲＮＡ占１％左逡逑右，其余均為以核糖、半乳糖為主的碳水化合物。蛋白質(zhì)是流感病毒粒子中最重要的組分，逡逑同時(shí)也是病毒發(fā)揮功能的主要介質(zhì)。逡逑第１－３基因節(jié)段分別編碼聚合酶堿性蛋白１邋（ＰＢ１）、聚合酶堿性蛋白２邋（ＰＢ２）和聚逡逑合酶酸性蛋白（ＰＡ）［Ｉ４］。它們可以形成復(fù)合體［１５１，在被病毒感染的細(xì)胞核內(nèi)催化病毒ＲＮＡ逡逑的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄［１４“６］。逡逑

圖２－２邋ＡＩＶ的結(jié)構(gòu)［ｌｌ］逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋Ａｖｉａｎ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋ｖｉｒｕｓｅｓ逡逑

織化學(xué)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，３株單克隆抗體均能在Ｈ７Ｎ９亞型ＡＩＶ感染的ＣＥＦ細(xì)胞中檢逡逑測(cè)到ＡＩＶ并發(fā)生特異性結(jié)合，陽(yáng)性細(xì)胞在顯微鏡下觀察到棕黃色，而在未被ＡＩＶ感染的逡逑ＣＥＦ細(xì)胞中則檢測(cè)不到ＡＩＶ，顯微鏡下只能觀察到淡藍(lán)色（如圖３－２）。逡逑Ａ邐Ｂ邐１邋？邐Ｗ逡逑二氣，＇邐ｉ邋…逡逑＇邐＊，．邐？邐－邋ｋ邋．逡逑／邐、邐．邐．邋Ｖ邐．夕鐿、逡逑？邐＊邐■：邐－？邐Ｖ－＊邐１＊－邐＊逡逑－邐？邋ｆ邐．邐＇邐．邐．／逡逑ｍ邋＾邐－邋ａ邐、，邐？邐和、‘邋．＼逡逑亡■逡逑，：’匕，、」、“邋＇Ａ＼４４卜，廣逡逑？：％－味邐”．＇、％邐＼逡逑■邐’邋．邋：ｄ邋、邋＇邋，、：逡逑圖３－２細(xì)胞免疫組化結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＩＨＣ邋ｉｎ邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ａ：對(duì)照；Ｂ：?jiǎn)慰梗矗牵矠橐豢沟拿庖呓M化；逡逑Ｃ：?jiǎn)慰梗担粒稙橐豢沟拿庖呓M化；Ｄ：?jiǎn)慰梗叮模睘橐豢沟拿庖呓M化逡逑Ａ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ；邋Ｂ：邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｕｓｉｎｇ邋４Ｇ２邋ＭｃＡｂ；逡逑Ｃ：邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｕｓｉｎｇ邋５Ａ６邋ＭｃＡｂ；邋Ｄ：邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｕｓｉｎｇ邋６Ｄ１邋ＭｃＡｂ逡逑３．６．８雞胚中和試驗(yàn)逡逑測(cè)定低致病性Ｈ７Ｎ９亞型禽流感病毒液的ＥＩＤ５０為１（Ｔ７６７

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本文編號(hào)：2766469