【摘要】：金黃色葡萄球菌(金葡菌)為革蘭氏陽(yáng)性菌,是一種人獸共患病病原,能引起人和動(dòng)物的多種疾病。金葡菌的致病性主要依靠表面蛋白、外分泌蛋白和多種酶。α-溶血素(Hla)是一種重要的外分泌蛋白,大量的研究表明Hla在金葡菌某些疾病的致病過(guò)程中起非常關(guān)鍵的作用,尤其是金葡菌性肺炎、乳房炎和角膜炎。以Hla為靶標(biāo)在抗金葡菌肺炎過(guò)程中具有重要意義,為此我們從體外溶血實(shí)驗(yàn)中篩選出具有抗Hla作用的百里香酚,然后從百里香酚對(duì)金葡菌Hla表達(dá)的影響、百里香酚對(duì)金葡菌Hla介導(dǎo)的肺癌上皮細(xì)胞A549損傷的保護(hù)作用、百里香酚對(duì)小鼠的急性毒性研究和百里香酚對(duì)小鼠金葡菌肺炎模型的保護(hù)作用的四個(gè)角度對(duì)小鼠金葡菌肺炎進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)。本文進(jìn)行了以下研究:1)通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)、繪制生長(zhǎng)曲線、檢測(cè)溶血活性、蛋白免疫印跡分析和熒光定量PCR(RT-PCR)研究百里香酚在體外對(duì)金葡菌Hla表達(dá)的影響。2)通過(guò)live/dead實(shí)驗(yàn)和乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性試驗(yàn)研究百里香酚對(duì)金葡菌Hla介導(dǎo)的肺癌上皮A549細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。3)觀察小鼠腹腔注射百里香酚后的臨床癥狀,并通過(guò)Bliss法計(jì)算百里香酚對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD_(50))。4)通過(guò)小鼠感染金葡菌的致死性保護(hù)率實(shí)驗(yàn)、組織病理學(xué)觀察、肺濕重/干重(W/D)比和肺菌落計(jì)數(shù)研究百里香酚對(duì)小鼠金葡菌肺炎損傷的保護(hù)作用。結(jié)果:百里香酚對(duì)金葡菌的不同菌株的MIC范圍為128-256μg/mL;百里香酚在0-32μg/mL濃度下對(duì)金葡菌USA300的生長(zhǎng)沒(méi)有影響;百里香酚具有抑制菌上清溶血的作用且呈一定的濃度依賴性,在濃度為32μg/mL時(shí),金葡菌USA300的溶血活性降至34.8%,差異極顯著(p0.01);在蛋白免疫印跡中百里香酚隨著濃度的增加條帶也是變?nèi)醯呐c溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致;金葡菌USA300 hla和RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄水平隨著藥物濃度的增加而降低,當(dāng)百里香酚濃度為32μg/mL時(shí),與對(duì)照組相比hla和RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄水平分別下降到5.5%和10.5%,差異極顯著(p0.01)。在金葡菌USA300與A549細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,隨著百里香酚濃度的增加,細(xì)胞死亡率減少,當(dāng)濃度為32μg/mL時(shí)LDH的釋放量為4.8%,差異極顯著(p0.01)。小鼠經(jīng)腹腔注射百里香酚后,臨床表現(xiàn)為:精神沉郁,活動(dòng)減少,身體抽搐,甚至死亡,其臨床癥狀隨著劑量的增加而變得更嚴(yán)重。百里香酚通過(guò)腹腔注射對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD_(50))為608.246 mg/kg,其95%的可信區(qū)間為500.149~807.214 mg/kg。百里香酚給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組(只感染8325-4組)相比,能顯著減少小鼠的死亡率(p0.05);觀察肺臟解剖病理學(xué)和組織病理學(xué)的特征,發(fā)現(xiàn)給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比肺部病理變化明顯減輕;給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比W/D值明顯降低(p0.05)。給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比肺臟菌落數(shù)明顯降低(p0.01),菌落計(jì)數(shù)分別為:1.1×10~5 CFUs/mg和6.8×10~7 CFUs/mg。結(jié)論:百里香酚通過(guò)下調(diào)hla和RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄水平而使Hla的表達(dá)下降;百里香酚對(duì)金葡菌USA300 Hla介導(dǎo)的肺癌上皮細(xì)胞A549的損傷具有保護(hù)作用;百里香酚對(duì)小鼠具有輕度毒性;百里香酚對(duì)小鼠金葡菌肺炎具有保護(hù)作用。該藥將有望成為治療金葡菌肺炎的新型藥物。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S853.74
【圖文】：

Song LZ et al., 1996, Science[8];B, Mc Gillivray DJ et al., 2009, Biophys J[17]）圖 1 金葡菌 α-溶血素七聚體結(jié)構(gòu)以及成孔機(jī)制A. Hla 七聚體，B. Hla 其具體插入脂質(zhì)雙分子層Fig. 1 Molecular graphics representation of the staphylococcal Hla and the heptameric porein the lipid bilayerA. Hla heptamer 232.4 KD. B. Membrane insertion of the heptametic pore.有研究發(fā)現(xiàn) Hla 在金葡菌致病過(guò)程中發(fā)揮了巨大的作用。Bubeck 等人[18]研究表明 α-溶血素基因缺失株對(duì)小鼠的致死率顯著降低，并未引起肺臟的損傷，該結(jié)果提示 α-溶血素可導(dǎo)致肺部損傷，并參與肺菌落定殖和免疫逃避。Bartlett 等人[19]研究結(jié)果表明 α-溶血素在金葡菌肺炎致病過(guò)程中可促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生和炎癥細(xì)胞因子的釋放并加重肺部炎癥的病理變化。在 Mcelroy 的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) α-溶血素間接作用于肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞，引起該細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致肺氣血屏

（Bronner S et al., 2004, FEMS Microbiol Rev[25]）圖 2 金葡菌 Hla 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示意圖Fig. 2 Schematic figure showing how the expression ofhla is regulated in S. aureus by multiple interactions between regulatory factorsNote：Green and red arrows indicate positive and negative regulation, respectivelyAgr 系統(tǒng)是金葡菌致病因子最主要的調(diào)控系統(tǒng)，它受環(huán)境信號(hào)的影響如細(xì)菌密度、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和能量利用率[26, 27]。Agr 系統(tǒng)調(diào)控著金葡菌重要的毒素（α-，β-和 γ-溶血素，TSST-1，腸毒素 B 以及 PVL）和各種酶（絲氨酸蛋白酶，V8 蛋白酶，葡萄球菌激酶，甘油酯水解酶，核酸酶，脂肪酶，PI-磷脂酶 C 和纖維蛋白溶酶）[28-33]。Dunman 等[34]人通過(guò) Agr 突變基因的轉(zhuǎn)錄分析驗(yàn)證了 Agr 系統(tǒng)的作用。其中 RNAII 和 RNAIII 是金葡菌 Agr 系統(tǒng)的兩大核心組成部分，如圖 3 所

再通過(guò) AgrB 將其排除，最終形成 AIP。在閾值濃度下， AgrC 與 AIP 結(jié)合后進(jìn)行自磷酸化，形成 AgrA，從而激活 P2 和 P3 啟成 RNAIII[35]。這將導(dǎo)致 RNAIII 的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)從而使毒素和酶的表達(dá)溶血素、蛋白酶、脂肪酶、腸毒素和 TSST-1，于此同時(shí) AgrA 與啟動(dòng)子增加了 RNAII 的轉(zhuǎn)錄水平，為 agrB、agrD、agrC 和 agrA 操縱子創(chuàng)造反饋環(huán)[37]。此外，AgrA 還可以從兩個(gè)啟動(dòng)子中調(diào)控酚可溶性蛋白（PS錄和表達(dá)[38]。

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本文編號(hào)：2764553