發(fā)布時間：2020-07-20 14:27

【摘要】：胸腺是T細胞發(fā)育的場所,其穩(wěn)態(tài)的維持對免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育具有重要意義。由于血-胸腺屏障的存在,胸腺曾經被視為免疫豁免器官,在感染性疾病的研究和防治工作中被忽視。近來大量的證據表明胸腺是多種病原物的靶器官。鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)是一類具有嚴重危害性的人畜禽共患病原微生物,該菌感染可導致雛禽多個器官損傷,甚至個體死亡。然而有關該菌感染對雛雞胸腺的影響及其機理的研究極為匱乏。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是該菌的主要毒力因子,常用于該菌致病機制的研究。LncRNAs是近來發(fā)現的一類不編碼蛋白質的長鏈RNA,可直接以RNA形式調控生命活動。轉錄組研究可以全面地反映所有RNA的表達規(guī)律和功能屬性,在家禽疾病研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。因此,本研究的目的是首先從器官、組織和細胞層面檢測S.Typhimurium及其LPS刺激對雛雞胸腺的影響,然后進一步從mRNAs和lncRNAs轉錄組層面系統(tǒng)地研究LPS刺激誘導雛雞胸腺損傷的機制,進而為家禽細菌性疾病的防控提供理論基礎。本研究取得的主要結果如下:(1)S.Typhimurium感染導致雛雞胸腺損傷,表現為細胞大量死亡和器官萎縮。與生理鹽水組相比,雛雞胸腺皮質區(qū)細胞死亡數目在5×10~4 CFU S.Typhimurium感染后36 h達到最大值,顯著增加到3.81倍(P0.05)。胸腺重量和胸腺指數在細菌感染后72 h達到最小值,分別顯著下降了43%(P0.01)和26%(P0.05)。HE染色結果顯示,雛雞胸腺組織皮質和髓質分界清晰,結構完整。(2)Salmonella LPS刺激比沙門氏菌刺激更快地誘導雛雞胸腺損傷。與生理鹽水組相比,雛雞胸腺皮質區(qū)細胞死亡數目在50 mg/kg Salmonella LPS刺激后12 h達到最大值,Formamide-MAb和TUNEL方法檢測到細胞死亡數目分別顯著增加到2.95倍和5.23倍(P0.001)。雛雞胸腺質量和胸腺指數在LPS刺激后36 h達到最小值,分別顯著下降了35%(P0.01)和20%(P0.05)。胸腺組織結構在LPS刺激后同樣未受到破壞。此外,脾臟中chT1+細胞亞群的比例,以及脾臟和胸腺中的CD4~+/CD8~+細胞亞群的比例在LPS刺激后36 h均未發(fā)生顯著變化。雛雞胸腺髓質區(qū)和皮髓質交界處的肥大細胞數量以及皮質區(qū)的巨噬細胞標記物LEP100的表達在LPS刺激后12 h達到最大值,分別顯著增加到1.90和3.69倍(P0.05)。(3)1767個雛雞胸腺mRNAs在Salmonella LPS刺激后顯著差異表達(P0.001,|log_2(fold change)|≥0.585)。Poly(A)+RNA-seq獲得158978794個高質量的長50 bp的單端有效讀段(clean reads),其中約77.05%的讀段可以匹配到雞的基因組。873、536和856個mRNAs的表達量在12 h vs.0 h、36 h vs.0 h和72 h vs.0 h的比較中存在顯著差異。在12 h vs.0 h比較中上調mRNAs被注釋到炎癥反應、免疫反應等過程,以及急性時相反應信號等通路;下調mRNAs被注釋到細胞分裂、染色體分離等過程,以及Polo樣激酶介導的有絲分裂等通路。在36 h vs.0h比較中上調mRNAs被注釋到抗菌應答、抗革蘭氏陰性菌應答等過程,以及急性時相反應信號等通路;下調mRNAs被注釋到著絲粒組裝和染色體分離等過程。在72 h vs.0 h比較中上調mRNAs主要與代謝活動相關;下調mRNAs主要與細胞死亡、代謝和免疫活動相關。因此,在雛雞胸腺損傷最嚴重的時期(12 h和36 h),差異表達的胸腺mRNAs主要涉及免疫反應和細胞分裂活動。整合通路分析結果進一步顯示LPS可能通過TLR4-MAPKs-FOS/JUN通路誘導雛雞胸腺的炎癥反應,進而促使DNA損傷和細胞周期阻礙。(4)鑒定了5520個雛雞胸腺lncRNAs。rRNA-depleted RNA-seq獲得385393591對高質量的長150 bp的雙末端有效讀段,其中約79.66%的讀段可以匹配到雞的基因組。通過讀段的組裝和轉錄本的篩選,最終鑒定了2283個基因間型lncRNAs、2810個內含子型lncRNAs和427個反義鏈型lncRNAs。88.59%的lncRNAs是最新發(fā)現。與雞mRNAs相比,雞lncRNAs的外顯子較長,外顯子數目較少。(5)111個雛雞胸腺lncRNAs在Salmonella LPS刺激后顯著差異表達(Q-value0.05,|log_2(fold change)|≥1)。在12 h vs.0 h比較中有47個lncRNAs差異表達,它們分別對應了1260個鄰近mRNAs(cis-mRNAs)和2811個共表達mRNAs(co-mRNAs)。在36 h vs.0 h比較中有81個lncRNAs差異表達,分別對應了1766個cis-mRNAs和3203個co-mRNAs。在12 h vs.0 h比較中差異表達lncRNAs的cis-mRNAs注釋于染色質沉默和蛋白激酶的負調節(jié)等過程,以及賈納斯激酶-信號傳導及轉錄活化因子和絲裂原活化蛋白激酶信號等通路;差異表達lncRNAs的co-mRNAs注釋于細胞分裂和LPS應答等過程,以及細胞周期等通路。在36 h vs.0 h比較中差異表達lncRNAs的cis-mRNAs注釋于免疫反應和細胞分裂等過程,以及卵母細胞減數分裂和賈納斯激酶-信號傳導及轉錄活化因子等通路;差異表達lncRNAs的co-mRNAs注釋于炎癥反應和細胞分裂等過程,以及細胞周期、細胞因子和細胞因子受體互作等通路。因此,在雛雞胸腺損傷最嚴重的時期,差異表達的胸腺lncRNAs也主要涉及炎癥反應和細胞分裂活動。通路可視化分析結果進一步顯示在TLR-MAPKs-Cytokines和細胞周期通路中的大部分mRNAs均有與之共表達或者鄰近的lncRNAs,因而lncRNAs也可能通過以上這些通路參與Salmonella LPS誘導的雛雞胸腺損傷過程。(6)實時熒光定量PCR試驗檢測了22個mRNAs和6個lncRNAs的表達。為驗證RNA-seq結果,將10個差異mRNAs的實時熒光定量PCR結果與Poly(A)+RNA-seq結果進行比較,二者表達趨勢一致,具有顯著強相關性(P=1.65e-8,r=0.828)。6個差異lncRNAs的表達模式也與rRNA-depleted RNA-seq結果基本一致,且二者同樣具有顯著強相關性(P=2.28e-4,r=0.871)。因而Poly(A)+RNA-seq和rRNA-depleted RNA-seq可以分別真實地反應雛雞胸腺mRNAs和lncRNAs的表達模式。在LPS誘導的雛雞胸腺損傷過程中,基因轉錄變化很迅速,6個mRNAs的表達量早在刺激后2~6 h顯著上調。S.Typhimurium感染誘導確實可以使如上10個mRNAs的表達呈現類似的趨勢,但是其峰值相對LPS刺激滯后。因此,S.Typhimurium可能主要通過LPS來影響雛雞胸腺基因表達。除了以上10個mRNAs以外,Poly(A)+RNA-seq和實時熒光定量PCR試驗均顯示LPS刺激可以上調雛雞胸腺TLR4通路和氧化應激通路中的6個mRNAs的表達,下調細胞周期6個mRNAs的表達。綜上所述,本研究證明了S.Typhimurium感染及其LPS刺激均可導致雛雞胸腺損傷。TLR4-MAPKs-FOS/JUN通路在這個過程中可能起著重要的調節(jié)作用,lncRNAs也可能通過如上通路參與了LPS誘導的雛雞胸腺損傷過程。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.31
【圖文】：

圖 1.1 胸腺細胞微環(huán)境結構 (Anderson and Jenkinson 2001)Fig. 1.1Anatomical microenvironment of thymus (Anderson and Jenkinson 2001)1.2.2 胸腺的免疫屏障血管造影以及針對血管和淋巴樣內皮細胞抗原的免疫組化試驗結果顯示，胸腺皮質和髓質內存在血管網絡和淋巴管系統(tǒng)(Raviola and Karnovsky 1972, Odaka et al2006)。由于已有證據僅支持胸腺的淋巴管具有輸出而非輸入功能(Williams et al1971)，血管可能是外界病原物進入胸腺的潛在通道。血胸屏障是胸腺的一種防護性物理屏障，可以在一定程度上阻擋抗原分子的進入。它位于胸腺皮質區(qū)，由無通透性的血管內皮細胞、基膜和其它基質細胞組成，可阻礙大分子示蹤劑通過；而髓質血管的通透性則較強，可允許各種分子量的示蹤劑通過，但是進入到髓質的示蹤劑不會擴散到皮質(Ribatti 2015) （圖 1.2）。雞胸腺皮質區(qū)血管有完整的基膜，髓質區(qū)的基膜是不連續(xù)的，從形態(tài)學上支持了雞皮質

圖 1.2 胸腺血管的通透性（A）皮質血管；（B）髓質血管。通過靜脈給小鼠注射辣根過氧化物酶后 5 min 進行取材和染色，示蹤劑的黑色的陽性信號只局限于皮質血管腔中，擴散到髓質血管外淋巴細胞的間隙(Ribatti 2015)。Fig 1.2 The permeability of vessels in thymus(A) Vessels in cortex; (B) Vessels in medulla. Sample the mice at 5 min after injected with horseradish peroxidaseand do staining, the dark positive signals were only observed in the vessel lumen in cortex (A), but outside of thevessel and around lymphocytes in medulla (B) (Ribatti 2015).1.2.3 胸腺是病原微生物的靶器官近來研究表明，胸腺可被多種病原微生物感染，如病毒、細菌、真菌和寄生蟲(Savino 2006)。因此，病原微生物感染對胸腺的影響應該引起足夠的重視。1.2.3.1 病原微生物感染對胸腺的影響

鼠傷寒沙門氏菌 LPS 誘導雛雞胸腺損傷機制的轉錄組學研究2012)。但 S. Typhimurium SL3261 感染并不會破壞小鼠胸腺的組織結構(Ross et al2012)。此外，胸腺微環(huán)境中信號分子的表達可能被擾亂，譬如克氏錐蟲和伯氏瘧原蟲感染均可誘導纖連蛋白、層粘連蛋白和趨化因子 CXCL12 在胸腺組織中的沉積(Cotta-de-Almeida et al 2003, Mendes-da-Cruz et al 2006, Gameiro et al 2010b)。

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本文編號：2763567