【摘要】：胸腺是T細(xì)胞發(fā)育的場(chǎng)所,其穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育具有重要意義。由于血-胸腺屏障的存在,胸腺曾經(jīng)被視為免疫豁免器官,在感染性疾病的研究和防治工作中被忽視。近來(lái)大量的證據(jù)表明胸腺是多種病原物的靶器官。鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)是一類具有嚴(yán)重危害性的人畜禽共患病原微生物,該菌感染可導(dǎo)致雛禽多個(gè)器官損傷,甚至個(gè)體死亡。然而有關(guān)該菌感染對(duì)雛雞胸腺的影響及其機(jī)理的研究極為匱乏。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是該菌的主要毒力因子,常用于該菌致病機(jī)制的研究。LncRNAs是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類不編碼蛋白質(zhì)的長(zhǎng)鏈RNA,可直接以RNA形式調(diào)控生命活動(dòng)。轉(zhuǎn)錄組研究可以全面地反映所有RNA的表達(dá)規(guī)律和功能屬性,在家禽疾病研究中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。因此,本研究的目的是首先從器官、組織和細(xì)胞層面檢測(cè)S.Typhimurium及其LPS刺激對(duì)雛雞胸腺的影響,然后進(jìn)一步從mRNAs和lncRNAs轉(zhuǎn)錄組層面系統(tǒng)地研究LPS刺激誘導(dǎo)雛雞胸腺損傷的機(jī)制,進(jìn)而為家禽細(xì)菌性疾病的防控提供理論基礎(chǔ)。本研究取得的主要結(jié)果如下:(1)S.Typhimurium感染導(dǎo)致雛雞胸腺損傷,表現(xiàn)為細(xì)胞大量死亡和器官萎縮。與生理鹽水組相比,雛雞胸腺皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞死亡數(shù)目在5×10~4 CFU S.Typhimurium感染后36 h達(dá)到最大值,顯著增加到3.81倍(P0.05)。胸腺重量和胸腺指數(shù)在細(xì)菌感染后72 h達(dá)到最小值,分別顯著下降了43%(P0.01)和26%(P0.05)。HE染色結(jié)果顯示,雛雞胸腺組織皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清晰,結(jié)構(gòu)完整。(2)Salmonella LPS刺激比沙門氏菌刺激更快地誘導(dǎo)雛雞胸腺損傷。與生理鹽水組相比,雛雞胸腺皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞死亡數(shù)目在50 mg/kg Salmonella LPS刺激后12 h達(dá)到最大值,Formamide-MAb和TUNEL方法檢測(cè)到細(xì)胞死亡數(shù)目分別顯著增加到2.95倍和5.23倍(P0.001)。雛雞胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)在LPS刺激后36 h達(dá)到最小值,分別顯著下降了35%(P0.01)和20%(P0.05)。胸腺組織結(jié)構(gòu)在LPS刺激后同樣未受到破壞。此外,脾臟中chT1+細(xì)胞亞群的比例,以及脾臟和胸腺中的CD4~+/CD8~+細(xì)胞亞群的比例在LPS刺激后36 h均未發(fā)生顯著變化。雛雞胸腺髓質(zhì)區(qū)和皮髓質(zhì)交界處的肥大細(xì)胞數(shù)量以及皮質(zhì)區(qū)的巨噬細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)EP100的表達(dá)在LPS刺激后12 h達(dá)到最大值,分別顯著增加到1.90和3.69倍(P0.05)。(3)1767個(gè)雛雞胸腺mRNAs在Salmonella LPS刺激后顯著差異表達(dá)(P0.001,|log_2(fold change)|≥0.585)。Poly(A)+RNA-seq獲得158978794個(gè)高質(zhì)量的長(zhǎng)50 bp的單端有效讀段(clean reads),其中約77.05%的讀段可以匹配到雞的基因組。873、536和856個(gè)mRNAs的表達(dá)量在12 h vs.0 h、36 h vs.0 h和72 h vs.0 h的比較中存在顯著差異。在12 h vs.0 h比較中上調(diào)mRNAs被注釋到炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等過(guò)程,以及急性時(shí)相反應(yīng)信號(hào)等通路;下調(diào)mRNAs被注釋到細(xì)胞分裂、染色體分離等過(guò)程,以及Polo樣激酶介導(dǎo)的有絲分裂等通路。在36 h vs.0h比較中上調(diào)mRNAs被注釋到抗菌應(yīng)答、抗革蘭氏陰性菌應(yīng)答等過(guò)程,以及急性時(shí)相反應(yīng)信號(hào)等通路;下調(diào)mRNAs被注釋到著絲粒組裝和染色體分離等過(guò)程。在72 h vs.0 h比較中上調(diào)mRNAs主要與代謝活動(dòng)相關(guān);下調(diào)mRNAs主要與細(xì)胞死亡、代謝和免疫活動(dòng)相關(guān)。因此,在雛雞胸腺損傷最嚴(yán)重的時(shí)期(12 h和36 h),差異表達(dá)的胸腺mRNAs主要涉及免疫反應(yīng)和細(xì)胞分裂活動(dòng)。整合通路分析結(jié)果進(jìn)一步顯示LPS可能通過(guò)TLR4-MAPKs-FOS/JUN通路誘導(dǎo)雛雞胸腺的炎癥反應(yīng),進(jìn)而促使DNA損傷和細(xì)胞周期阻礙。(4)鑒定了5520個(gè)雛雞胸腺lncRNAs。rRNA-depleted RNA-seq獲得385393591對(duì)高質(zhì)量的長(zhǎng)150 bp的雙末端有效讀段,其中約79.66%的讀段可以匹配到雞的基因組。通過(guò)讀段的組裝和轉(zhuǎn)錄本的篩選,最終鑒定了2283個(gè)基因間型lncRNAs、2810個(gè)內(nèi)含子型lncRNAs和427個(gè)反義鏈型lncRNAs。88.59%的lncRNAs是最新發(fā)現(xiàn)。與雞mRNAs相比,雞lncRNAs的外顯子較長(zhǎng),外顯子數(shù)目較少。(5)111個(gè)雛雞胸腺lncRNAs在Salmonella LPS刺激后顯著差異表達(dá)(Q-value0.05,|log_2(fold change)|≥1)。在12 h vs.0 h比較中有47個(gè)lncRNAs差異表達(dá),它們分別對(duì)應(yīng)了1260個(gè)鄰近mRNAs(cis-mRNAs)和2811個(gè)共表達(dá)mRNAs(co-mRNAs)。在36 h vs.0 h比較中有81個(gè)lncRNAs差異表達(dá),分別對(duì)應(yīng)了1766個(gè)cis-mRNAs和3203個(gè)co-mRNAs。在12 h vs.0 h比較中差異表達(dá)lncRNAs的cis-mRNAs注釋于染色質(zhì)沉默和蛋白激酶的負(fù)調(diào)節(jié)等過(guò)程,以及賈納斯激酶-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)等通路;差異表達(dá)lncRNAs的co-mRNAs注釋于細(xì)胞分裂和LPS應(yīng)答等過(guò)程,以及細(xì)胞周期等通路。在36 h vs.0 h比較中差異表達(dá)lncRNAs的cis-mRNAs注釋于免疫反應(yīng)和細(xì)胞分裂等過(guò)程,以及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和賈納斯激酶-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子等通路;差異表達(dá)lncRNAs的co-mRNAs注釋于炎癥反應(yīng)和細(xì)胞分裂等過(guò)程,以及細(xì)胞周期、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體互作等通路。因此,在雛雞胸腺損傷最嚴(yán)重的時(shí)期,差異表達(dá)的胸腺lncRNAs也主要涉及炎癥反應(yīng)和細(xì)胞分裂活動(dòng)。通路可視化分析結(jié)果進(jìn)一步顯示在TLR-MAPKs-Cytokines和細(xì)胞周期通路中的大部分mRNAs均有與之共表達(dá)或者鄰近的lncRNAs,因而lncRNAs也可能通過(guò)以上這些通路參與Salmonella LPS誘導(dǎo)的雛雞胸腺損傷過(guò)程。(6)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)檢測(cè)了22個(gè)mRNAs和6個(gè)lncRNAs的表達(dá)。為驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果,將10個(gè)差異mRNAs的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與Poly(A)+RNA-seq結(jié)果進(jìn)行比較,二者表達(dá)趨勢(shì)一致,具有顯著強(qiáng)相關(guān)性(P=1.65e-8,r=0.828)。6個(gè)差異lncRNAs的表達(dá)模式也與rRNA-depleted RNA-seq結(jié)果基本一致,且二者同樣具有顯著強(qiáng)相關(guān)性(P=2.28e-4,r=0.871)。因而Poly(A)+RNA-seq和rRNA-depleted RNA-seq可以分別真實(shí)地反應(yīng)雛雞胸腺mRNAs和lncRNAs的表達(dá)模式。在LPS誘導(dǎo)的雛雞胸腺損傷過(guò)程中,基因轉(zhuǎn)錄變化很迅速,6個(gè)mRNAs的表達(dá)量早在刺激后2~6 h顯著上調(diào)。S.Typhimurium感染誘導(dǎo)確實(shí)可以使如上10個(gè)mRNAs的表達(dá)呈現(xiàn)類似的趨勢(shì),但是其峰值相對(duì)LPS刺激滯后。因此,S.Typhimurium可能主要通過(guò)LPS來(lái)影響雛雞胸腺基因表達(dá)。除了以上10個(gè)mRNAs以外,Poly(A)+RNA-seq和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)均顯示LPS刺激可以上調(diào)雛雞胸腺TLR4通路和氧化應(yīng)激通路中的6個(gè)mRNAs的表達(dá),下調(diào)細(xì)胞周期6個(gè)mRNAs的表達(dá)。綜上所述,本研究證明了S.Typhimurium感染及其LPS刺激均可導(dǎo)致雛雞胸腺損傷。TLR4-MAPKs-FOS/JUN通路在這個(gè)過(guò)程中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用,lncRNAs也可能通過(guò)如上通路參與了LPS誘導(dǎo)的雛雞胸腺損傷過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.31
【圖文】：

圖 1.1 胸腺細(xì)胞微環(huán)境結(jié)構(gòu) (Anderson and Jenkinson 2001)Fig. 1.1Anatomical microenvironment of thymus (Anderson and Jenkinson 2001)1.2.2 胸腺的免疫屏障血管造影以及針對(duì)血管和淋巴樣內(nèi)皮細(xì)胞抗原的免疫組化試驗(yàn)結(jié)果顯示，胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)內(nèi)存在血管網(wǎng)絡(luò)和淋巴管系統(tǒng)(Raviola and Karnovsky 1972, Odaka et al2006)。由于已有證據(jù)僅支持胸腺的淋巴管具有輸出而非輸入功能(Williams et al1971)，血管可能是外界病原物進(jìn)入胸腺的潛在通道。血胸屏障是胸腺的一種防護(hù)性物理屏障，可以在一定程度上阻擋抗原分子的進(jìn)入。它位于胸腺皮質(zhì)區(qū)，由無(wú)通透性的血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和其它基質(zhì)細(xì)胞組成，可阻礙大分子示蹤劑通過(guò)；而髓質(zhì)血管的通透性則較強(qiáng)，可允許各種分子量的示蹤劑通過(guò)，但是進(jìn)入到髓質(zhì)的示蹤劑不會(huì)擴(kuò)散到皮質(zhì)(Ribatti 2015) （圖 1.2）。雞胸腺皮質(zhì)區(qū)血管有完整的基膜，髓質(zhì)區(qū)的基膜是不連續(xù)的，從形態(tài)學(xué)上支持了雞皮質(zhì)

圖 1.2 胸腺血管的通透性（A）皮質(zhì)血管；（B）髓質(zhì)血管。通過(guò)靜脈給小鼠注射辣根過(guò)氧化物酶后 5 min 進(jìn)行取材和染色，示蹤劑的黑色的陽(yáng)性信號(hào)只局限于皮質(zhì)血管腔中，擴(kuò)散到髓質(zhì)血管外淋巴細(xì)胞的間隙(Ribatti 2015)。Fig 1.2 The permeability of vessels in thymus(A) Vessels in cortex; (B) Vessels in medulla. Sample the mice at 5 min after injected with horseradish peroxidaseand do staining, the dark positive signals were only observed in the vessel lumen in cortex (A), but outside of thevessel and around lymphocytes in medulla (B) (Ribatti 2015).1.2.3 胸腺是病原微生物的靶器官近來(lái)研究表明，胸腺可被多種病原微生物感染，如病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)(Savino 2006)。因此，病原微生物感染對(duì)胸腺的影響應(yīng)該引起足夠的重視。1.2.3.1 病原微生物感染對(duì)胸腺的影響

鼠傷寒沙門氏菌 LPS 誘導(dǎo)雛雞胸腺損傷機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究2012)。但 S. Typhimurium SL3261 感染并不會(huì)破壞小鼠胸腺的組織結(jié)構(gòu)(Ross et al2012)。此外，胸腺微環(huán)境中信號(hào)分子的表達(dá)可能被擾亂，譬如克氏錐蟲(chóng)和伯氏瘧原蟲(chóng)感染均可誘導(dǎo)纖連蛋白、層粘連蛋白和趨化因子 CXCL12 在胸腺組織中的沉積(Cotta-de-Almeida et al 2003, Mendes-da-Cruz et al 2006, Gameiro et al 2010b)。

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本文編號(hào)：2763567