【摘要】：戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是一種引起人獸共患病的RNA病毒,HEV跨物種侵染以及持續(xù)性感染一直都是研究熱點(diǎn)。我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó),飼養(yǎng)者與豬群發(fā)生近距離接觸以及豬肉制品的食用都大大增加了HEV從豬及其肉制品傳播給人群的風(fēng)險(xiǎn)幾率。我們利用血清學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及生物信息學(xué)分析手段開展了豬源和人源HEV遺傳進(jìn)化特征以及HEV持續(xù)性感染對(duì)細(xì)胞影響的相關(guān)研究,為今后進(jìn)一步開展HEV遺傳進(jìn)化以及宿主抗病毒機(jī)制提供參考依據(jù)。本研究首先對(duì)我國(guó)7個(gè)省份的豬群進(jìn)行了HEV血清學(xué)調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這7個(gè)省份養(yǎng)豬場(chǎng)豬群感染過(guò)HEV的比例較高,其中育種豬是HEV傳播的高風(fēng)險(xiǎn)因素,飼養(yǎng)豬齡在HEV傳播過(guò)程中也扮演著重要作用,但是飼養(yǎng)豬群的地理環(huán)境不影響HEV的傳播。首次從甘肅省豬群中獲得genotype(gt)4e亞型HEV毒株基因組序列,這與我國(guó)目前報(bào)道的HEV在人群和豬群中流行的基因型為gt 4是相符的,這進(jìn)一步說(shuō)明豬源HEV對(duì)我國(guó)公共衛(wèi)生存在一定威脅。鑒于較高程度HEV在豬群中的流行態(tài)勢(shì)對(duì)人類健康帶來(lái)的現(xiàn)實(shí)威脅,我們利用生物信息學(xué)方法對(duì)比了豬源和人源HEV在分子進(jìn)化上的異同點(diǎn),發(fā)現(xiàn)在同義密碼子使用模式上gt 1、gt 3和gt 4 HEV毒株開放閱讀框(open reading frames,ORFs)同義密碼子使用模式均存在遺傳學(xué)差異,但是gt 1 HEV ORF具有的同義密碼子使用模式呈現(xiàn)出基因型特異性,這種密碼子使用偏嗜性強(qiáng)于無(wú)論是人源還是豬源的gt 3和gt 4 HEV毒株。對(duì)于gt 3和gt 4 HEV毒株來(lái)說(shuō),豬源HEV毒株比人源HEV毒株在密碼子使用模式上更加適應(yīng)人和豬的密碼子使用模式。這在進(jìn)化層面上表明HEV在面對(duì)宿主施加的選擇壓力下表現(xiàn)出適應(yīng)宿主細(xì)胞環(huán)境的進(jìn)化傾向。為了進(jìn)一步分析HEV在適應(yīng)宿主細(xì)胞的過(guò)程中對(duì)細(xì)胞在整體生物學(xué)功能方面的影響程度,我們利用HEV持續(xù)性感染細(xì)胞模型和轉(zhuǎn)錄組分析手段分析了HEV持續(xù)性感染對(duì)宿主細(xì)胞的影響后發(fā)現(xiàn),病毒對(duì)所侵染細(xì)胞代謝通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響較大,這也說(shuō)明持續(xù)性感染狀態(tài)下的細(xì)胞與病毒在某種程度上進(jìn)行了“妥協(xié)”。然而,被感染細(xì)胞也會(huì)利用自身免疫反應(yīng)來(lái)抵抗HEV對(duì)其造成的持續(xù)性感染。在檢測(cè)的14種免疫基因轉(zhuǎn)錄水平變化中,I、II和III型IFN基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào),以及ISG15、ISG56和MX1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。與此同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)IL-6這種與抗病毒和炎癥反應(yīng)相關(guān)的白細(xì)胞介素在HEV持續(xù)性感染中也顯著性上調(diào)了其轉(zhuǎn)錄水平。此外,在病毒性肝炎中具有重要免疫學(xué)活性的趨化因子CCL5和CXCL10基因轉(zhuǎn)錄水平顯著提升,其中CXCL10基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的幅度最高,說(shuō)明與CXCL10相關(guān)的抗病毒免疫反應(yīng)在HEV持續(xù)性感染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用�；谏鲜鏊l(fā)現(xiàn)的IL-6、CCL5以及CXCL10在HEV持續(xù)性感染中轉(zhuǎn)錄水平的顯著性變化,這為今后研究人員基于這些細(xì)胞因子作為靶點(diǎn)為臨床治療提供一些新的思路。本研究結(jié)果拓寬了HEV跨宿主傳播過(guò)程中分子進(jìn)化以及持續(xù)性感染過(guò)程中病毒-細(xì)胞互作的認(rèn)知,為理解豬源HEV侵染人體所具備的遺傳特征以及宿主細(xì)胞應(yīng)對(duì)HEV持續(xù)性感染的各種反應(yīng)機(jī)制提供了可以參考的信息。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）所引起的感染在世界范圍內(nèi)大多數(shù)臨床癥狀表現(xiàn)為急性感染，每年被 HEV 所感染人口約有兩千萬(wàn)，其中由 genotype(gt) 1 和 gt 2 HEV 毒株造成的死亡病例高達(dá) 7 萬(wàn)人[1]。然而，占大多數(shù)的感染病例并不表現(xiàn)出典型的臨床癥狀[2]。印度目前被認(rèn)為是 HEV 的發(fā)源地（二十世紀(jì)80 年代），通過(guò)流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn) HEV 對(duì)水源的污染是造成不同于甲型肝炎(hepatitis A)和乙型肝炎(hepatitis B)的一種急性病毒性肝炎[3,4]。在 1983 年，研究人員首次通過(guò)免疫電子顯微鏡(immune electron microscopy)在來(lái)自于 HEV 流行疫區(qū)的志愿者糞便中觀察到了 HEV 的大致形態(tài)[5]。在 1990 年，HEV 實(shí)現(xiàn)了分子克隆，這對(duì)于利用血清學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及針對(duì) HEV 大規(guī)模進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[6,7]。HEV 在分類學(xué)上屬于肝炎病毒科(Hepeviridae family)中 Orthohepevirus 屬成員，此種病毒具有多種基因型毒株，并且易感宿主范圍十分寬廣（圖 1.1）[8]。從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的哺乳動(dòng)物都對(duì) HEV 不同基因型的毒株易感，gt 1 和 gt 2 HEV 主要易感宿主就是人類，而 gt 3 和 gt 4 HEV 的易感宿主譜廣泛，這也是導(dǎo)致 HEV 成為人獸共患病的主要毒株群。

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆博士學(xué)位論文發(fā)生了數(shù)次裂解[42]。在這些裂解的病毒蛋白中，N 末端大小為 35kDa 的片段是利用質(zhì)譜分析鑒定為甲基化轉(zhuǎn)移酶。在相同的研究中，一種細(xì)胞滲透性絲氨酸酶阻遏物(cell-permeable cysteine protease inhibitor)（E-64d）可以阻止 ORF1 編碼的多聚蛋白裂解，但是這種方法無(wú)法確定 ORF1 編碼的多聚蛋白的裂解是受到病毒自身蛋白酶作用還是細(xì)胞自身蛋白酶的作用。

圖 1.3 HEV 病毒生命周期示意圖病毒粒子富集在靶細(xì)胞表面是通過(guò)識(shí)別硫酸肝素蛋白糖來(lái)進(jìn)行的（第一步）；接著結(jié)合一種尚未被鑒定出來(lái)的細(xì)胞表面受體（第二步）；HEV 病毒粒子侵入細(xì)胞內(nèi)部（第三步）；病毒粒子脫殼釋放 RNA 基因組（第四步）；釋放出來(lái)的 RNA 在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)（第五步）；RdRp 將正鏈 RNA基因組復(fù)制出負(fù)鏈 RNA 互補(bǔ)鏈（第六步）；以負(fù)鏈 RNA 為模板復(fù)制出長(zhǎng)約 2.2kb 的亞基因組（第七步a）以及全長(zhǎng) RNA 基因組（第七步 b）；亞基因組 RNA 表達(dá)出 ORF2 和 ORF3 蛋白（第八步）。ORF2蛋白將全長(zhǎng)子代 RNA 基因組包裝成子代病毒粒子（第九步），此外 ORF3 將細(xì)胞內(nèi)環(huán)境優(yōu)化成為對(duì) HEV增殖有利的內(nèi)環(huán)境（第十步 a）或者細(xì)胞膜利于子代病毒出芽（第十步 b）；ORF3 對(duì)出芽的子代病毒可以協(xié)助其結(jié)合脂類物質(zhì)（第 11 步）由此開始病毒對(duì)其他易感細(xì)胞的侵襲。Fig. 1.3 The life cycle of HEVStep 1: HEV particles get together to the surface of susceptible cells by heparin sulfate proteoglycans servingas attachment factors; Step 2: Viral particles bind to cells; Step 3: Viral particles are internalized; Step 4: HEVuncoats to release viral genome; Step 5: synthesize viral non-structural proteins; Step 6: RdRp replicates thepositive RNA sequence into the negative sense transcripts; Step 7: a, the negative sense strand serves astemplates for producing a 2.2 kb subgenomic RNA; b, at the same time producing the full-length viralgenome; Step 8: the subgenomic RNA expresses ORF2 and ORF3 proteins; Step 9: ORF2 protein packagesHEV genome to assemble offspring virus; Step 10: a, ORF3 protein

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本文編號(hào)：2763745