【摘要】：干擾素刺激因子Viperin定位在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴中,正常表達(dá)水平較低,在多種細(xì)胞中可被干擾素、脂多糖、poly(I:C)和多種病毒等誘導(dǎo)表達(dá),可以在機(jī)體抵抗病原過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前Viperin基因的抗炎和抗病毒作用主要集中在人類疾病的研究,有關(guān)豬Viperin基因的作用研究較少。本研究將構(gòu)建的豬Viperin基因真核表達(dá)載體PB-Viperin轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞,分別利用熒光顯微鏡觀察、RT-PCR和Western blot方法,篩選建立Viperin基因過(guò)表達(dá)PK15細(xì)胞系;為了探討豬Viperin的抗炎作用,以LPS處理PK15細(xì)胞為炎性反應(yīng)細(xì)胞模型,采用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)TLR4/NF-κB、JAK/STAT信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA和蛋白水平的表達(dá),評(píng)價(jià)過(guò)表達(dá)豬Viperin基因在細(xì)胞水平的抗炎作用;進(jìn)一步對(duì)豬Viperin基因的抗病毒作用進(jìn)行了初步研究,以CSFV感染Viperin過(guò)表達(dá)的PK15細(xì)胞為研究對(duì)象,從病毒滴度檢測(cè)、免疫熒光觀察法和Western blot蛋白水平檢測(cè)評(píng)價(jià)豬Viperin基因?qū)SFV復(fù)制的影響,利用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)IRF3和STAT1表達(dá),初步揭示豬Viperin基因抗CSFV的分子機(jī)制。結(jié)果如下:豬Viperin基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建:熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,PB-Viperin和PB空載轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光,說(shuō)明載體成功轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞;RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與PB空載轉(zhuǎn)染組相比,PB-Viperin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Viperin mRNA和蛋白表達(dá)顯著性升高,表明豬Viperin基因在PK15細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了過(guò)表達(dá),經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Viperin基因的PK15細(xì)胞系。豬Viperin基因的抗炎作用:LPS提高了TLR4、JAK/STAT通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平,即LPS激活了TLR4和JAK/STAT信號(hào)通路。RT-PCR結(jié)果顯示:PK-PBV細(xì)胞相較于PK-PB細(xì)胞的IL-6mRNA表達(dá)下降,Viperin mRNA表達(dá)上調(diào),且差異顯著。對(duì)照組中MyD88、TBK1、NF-κB、IRF3和IFNɑ等基因mRNA表達(dá)在PK-PB和PK-PBV中無(wú)明顯差異;LPS處理后,過(guò)表達(dá)Viperin能不同程度地下調(diào)TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵因子MyD88、TBK1、NF-κB、IRF3和IFNɑ等基因mRNA的表達(dá),且TBK1、NF-κB和IFNɑ的mRNA表達(dá)下降差異顯著。提示Viperin可能通過(guò)TLR4信號(hào)通路抑制細(xì)胞炎性反應(yīng)。LPS能提高PK-PB和PK-PBV中的STAT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平,與PK-PB相比,LPS組PK-PBV中的STAT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,Viperin mRNA和蛋白表達(dá)水平也發(fā)生了下調(diào)。提示過(guò)表達(dá)Viperin能降低LPS升高的STAT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。AG490抑制JAK-STAT通路后,STAT1蛋白表達(dá)水平顯著下降,而Viperin蛋白表達(dá)水平顯著上升。與LPS組相比,L+A組的STAT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,而Viperin mRNA和蛋白表達(dá)水平升高;與PK-PB細(xì)胞相比,PK-PBV中STAT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低;Viperin mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。提示Viperin可能通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/JAK/STAT通路發(fā)揮抗炎作用。豬Viperin基因的抗病毒作用:與PK-PB細(xì)胞相比,CSFV感染后病毒滴度明顯下降,下降幅度與CSFV的處理時(shí)間及感染復(fù)數(shù)有關(guān)。CSFV感染后E2蛋白表達(dá)顯著升高,與PK-PB細(xì)胞相比,CSFV感染后PK-PBV細(xì)胞中E2蛋白明顯減少。提示Viperin過(guò)表達(dá)能抑制CSFV E2蛋白表達(dá),說(shuō)明Viperin能抑制CSFV復(fù)制。CSFV感染后PK-PBV細(xì)胞中IRF3和STAT1的mRNA表達(dá)上調(diào),阻斷STAT信號(hào)后,PK-PBV細(xì)胞中IRF3和STAT1 mRNA表達(dá)上調(diào)。提示豬Viperin抑制CSFV復(fù)制可能通過(guò)JAK/STAT通路調(diào)控IRF3的表達(dá)進(jìn)行。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4
【圖文】：

N 末端結(jié)構(gòu)是由第 1-42 位氨基酸殘基構(gòu)成，且氨基酸序列在各個(gè)物種中表現(xiàn)較大的差異性。N 端蛋白區(qū)域包含兩親性的 α 螺旋結(jié)構(gòu)，位于基因的第 7-42 位氨基酸殘基，可以構(gòu)成亮氨酸拉鏈，不具有形成二聚體等拉鏈功能，可以結(jié)合到膜表面并誘導(dǎo)其扭曲[15]。保守的中間區(qū)域位于 Viperi蛋白的 77-209 氨基酸殘基，包含 M1-M4 共 4 個(gè)相對(duì)保守的基本序列，其基因序列和 S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）激酶家族的 MoA/PQQ111 具有較高同源性。其中 M1 含有保守的 C3ｘC2ｘC 序列，能夠與催化硫鐵簇結(jié)合，降低 SAM 向 5’脫氧腺苷轉(zhuǎn)換，屬于 SAM 酶超家族，故 Viperin 又稱為 RSAD2（Radical SAM domain containing 2）[16]。由 218-361 氨基酸殘基構(gòu)成的 C 端部分突出到細(xì)胞質(zhì)中，在不同的物種中，其氨基酸序列表現(xiàn)為高保守性，可能參與蛋白與蛋白互作或者介導(dǎo)酶活性的底物識(shí)別，發(fā)揮重要的抗病毒功能[17]。

促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子（Interferon regulatory factorIRF3 和 IRF7 進(jìn)而誘導(dǎo)合成 IFNβ，IFNβ 與細(xì)胞表面 I 型 IFNR 結(jié)合調(diào)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（Signal transducers and activators of transcription 1形成異源二聚體，與 IRF9 形成干擾素刺激基因因子 3（Interferon-st合物，ISGF3 復(fù)合物發(fā)生核移位，結(jié)合干擾素刺激應(yīng)答元件（IFN-stim及 ISG 啟動(dòng)子，誘導(dǎo) Viperin 基因的表達(dá)[21, 22]。依賴性通路中，巨細(xì)胞病毒（Cytomegaoviyns，CMV）[23]、VSV[24]ephalitis virus，JEV）[25]等病毒通過(guò)結(jié)合細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體上的線ndrial antiviral signaling protein，MAVS），激活 IRF1 或 IRF3，直接誘作用，如 VSV 直接通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子 IRF1 刺激 Viperin 基因表達(dá)上調(diào)，Jctivating protein-1，AP-1）上調(diào) Viperin 基因表達(dá)[25]。HCMV 囊膜糖]。VSV 由 MAVS 激活 IRFs 誘導(dǎo) Viperin 表達(dá)[27]。總之，干擾素依rin 基因的表達(dá)，干擾素非依賴性通路通過(guò) IRFl 和 IRF3 調(diào)節(jié) Viperin

圖 3 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果（200×）A：對(duì)照；B：轉(zhuǎn)染 PB 空載；C：轉(zhuǎn)染 PB-Viperin。Fig.3 Fluorescence microscope observate cell transfection result（200×）A: no transfection; B: PB Vector transfection; C: PB-Viperin transfection .豬 Viperin 基因在 PK15 細(xì)胞中表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖 4。由圖 4 可知，與PB 空載轉(zhuǎn)染組相比，PB-Vipe染細(xì)胞中的 Viperin 基因 mRNA 表達(dá)量明顯升高，且差異性極顯著（P < 0.001）。Western b果顯示，與 PB 空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，PB-Viperin 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的 Viperin 蛋白表達(dá)量明顯升高，異性顯著（P < 0.0001）。提示豬 Viperin 基因在 PK15 細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了過(guò)表達(dá)。將 PB-Viperin B 空載轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，分別命名為 PK15-PB-VipePK-PBV）細(xì)胞和 PK15-PB（PK-PB）細(xì)胞。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2760926