發(fā)布時間：2020-07-17 10:38

【摘要】：陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis,TV)是寄生在人體泌尿生殖系統(tǒng)的寄生性原蟲。它不僅能夠引起女性滴蟲性陰道炎和宮頸炎、男性尿道炎和前列腺炎,還可以感染小鼠和松鼠猴。呈世界性分布,是一種危害人獸健康的重要人獸共患寄生性原蟲。目前,尚無有效的防治方法,究其原因是由于對陰道毛滴蟲的細胞分子生物學特性的研究較少。而端粒是存在于真核細胞染色體末端的DNA重復序列與一些相關蛋白組成的特殊結構,由端粒酶進行調控。端粒及其相關蛋白的發(fā)現(xiàn)成為分子生命科學研究的熱點之一。在大多數(shù)真核生物中,包括原蟲,如賈第蟲,微小隱孢子蟲、利什曼原蟲及布氏錐蟲等端粒DNA重復序列及端粒相關蛋白均有研究。但是作為真核生物分支早期的陰道毛滴蟲,其端粒DNA重復序列的研究未見報道,通過生物信息學分析在陰道毛滴蟲基因組中并沒有端粒酶序列。那么是什么對陰道毛滴蟲端粒DNA的延伸進行調節(jié)。為此,本試驗將對陰道毛滴蟲端粒DNA及其調節(jié)蛋白進行研究。具體如下:端粒DNA重復序列鑒定:利用S1核酸酶及Mbo I限制性內切酶對陰道毛滴蟲基因組DNA切割并與pUC18載體相連后測序得出重復序列(TTTTAGGG)_n,長度約在2000 bp。通過BAL31核酸酶消化和FISH證明了該重復序列能夠定位于陰道毛滴蟲染色體末端,是陰道毛滴蟲的端粒DNA重復序列。端粒DNA與端粒結合蛋白TRF和TBP相互作用研究:應用原核表達技術構建端粒結合蛋白pET-TRF和pET-TBP原核表達載體,以Western blot及IIF和FISH聯(lián)合試驗對TRF和TBP在陰道毛滴蟲體內表達定位,EMSA研究TRF和TBP在體外與端粒DNA結合作用。Western blot結果顯示TRF和TBP均在細胞核中表達,是一種低表達的核蛋白。IIF和FISH聯(lián)合試驗證明了TRF和TBP都能夠與端粒DNA呈點狀部分共定位于陰道毛滴蟲細胞核染色體末端。EMSA中阻滯條帶表明了兩者均能夠在體外與雙鏈端粒DNA結合。端粒結合蛋白TRF和TBP對端粒DNA的影響:分別構建針對TRF和TBP的錘頭狀核酶TRF-HR和TBP-HR研究端粒結合蛋白TRF和TBP分別在體內對端粒DNA延伸的影響。體外切割試驗得出TRF-HR和TBP-HR能夠有效的對TRF和TBP的體外轉錄體進行切割,其效率分別為89.4%和92.1%。經(jīng)電穿孔轉染后熒光定量PCR檢測出TRF-HR和TBP-HR同樣能夠在體內對TRF和TBP進行切割,切割效率分別為82.6%及85.2%。Western blot分析顯示TRF和TBP在蛋白質水平上也明顯減少。通過Southern blot檢驗得出,在TRF和TBP減少時,端粒DNA重復序列長度反而增加,即陰道毛滴蟲TRF和TBP對端粒DNA延伸起到負調節(jié)作用。SPP對端粒DNA的影響:應用原核表達技術構建SPP原核表達載體pET-SPP,經(jīng)EMSA研究SPP在體外與端粒DNA結合作用。構建錘頭狀核酶SPP-HR研究SPP在體內對端粒DNA延伸的影響。EMSA中阻滯條帶表明了SPP能夠在體外與雙鏈端粒DNA結合。錘頭狀核酶SPP-HR體外切割試驗得出SPP-HR對SPP的體外轉錄體的切割效率為89.5%。電穿孔轉染至陰道毛滴蟲體內,熒光定量PCR分析表明SPP-HR仍能在體內對SPP進行切割,切割效率為84.6%。Western blot檢測得到SPP在蛋白質表達水平上也明顯減少。經(jīng)Southern blot檢驗得出,在SPP mRNA和蛋白質表達水平降低時,端粒DNA重復序列長度也隨之縮短,表明SPP對端粒DNA延伸起到正調節(jié)作用。PIKK與SPP相互作用及PIKK對端粒DNA的影響:構建pGEX-PIKK原核表達載體及含有陰道毛滴蟲α-SCSB啟動子的BiFC載體,采用GST-Pull down和BiFC試驗研究PIKK和SPP兩者之間的相互作用。構建錘頭狀核酶PIKK-HR研究PIKK在體內對端粒DNA延伸的影響。GST-pull down結果中能夠看到重組PIKK和SPP蛋白相互結合條帶。BiFC試驗更加直觀的檢測到紅色熒光,從而確定了PIKK和SPP在陰道毛滴蟲體內外均存在相互作用。錘頭狀核酶PIKK-HR體外切割試驗得出PIKK-HR對PIKK的體外轉錄體的切割效率為91.2%。電穿孔轉染至陰道毛滴蟲體內,熒光定量PCR分析表明PIKK-HR能在體內對PIKK進行切割,切割效率為86.7%。Western blot檢測得到PIKK在蛋白質表達水平上也明顯減少。經(jīng)Southern blot檢驗得出,在PIKK蛋白質表達水平降低時,端粒DNA重復序列長度也隨之縮短,說明PIKK對端粒DNA延伸起到正調節(jié)作用。綜上試驗研究表明,在不存在端粒酶的情況下,陰道毛滴蟲端粒DNA重復序列(TTTTAGGG)_n的延伸受到端粒結合蛋白TRF和TBP的負調節(jié),以及SPP和PIKK的正調節(jié)。為進一步研究陰道毛滴蟲端粒調控機制、陰道毛滴蟲分子生物學特性及陰道毛滴蟲永生化等方面提供了新的思路。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.72
【圖文】：

交：將已變性的探針滴加于標本蓋玻片上滌：將標本蓋玻片加入已預熱的 50 %甲酰預熱的 1×SSC 中洗滌 3 次，每次 5 min。核：DAPI 對細胞核染色 5 min，用 PBST片及鏡檢：滴加封片劑后，置于載玻片上滴蟲基因組 DNA 提取培養(yǎng)，收集陰道毛滴蟲提取總 DNA，進道毛滴蟲基因組 DNA 條帶清晰，可進行1 2

BAL31 核酸酶消化鑒定以(TTTTAGGG)5設計為地高辛標記探針，將陰道毛滴蟲基因組 DNA 間(0、20、40、60、80 min)BAL31 核酸酶及 Mbo I 消化后，與探針雜uthern blot，如圖 1-3 顯示，隨著時間的增加，端粒 DNA 序列逐漸降低圖 1-2 陰道毛滴蟲(TTTTAGGG)n重復序列Fig 1-2 The highly repetitive sequence (TTTTAGGG)nof T.vaginalis.

Southernblot分析

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9 張文忠;路應連;張青云;梁玉萍;;山西省陰道毛滴蟲調查簡報[J];山西醫(yī)學院學報;1988年01期

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本文編號：2759317