【摘要】：益生菌被聯(lián)合國(guó)(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)定義為活的微生物,當(dāng)使用合適的數(shù)量時(shí),將對(duì)人和動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生有益作用。益生菌可用于包括預(yù)防和治療腸道感染,泌尿生殖系統(tǒng)疾病,細(xì)菌性陰道病和皮膚病等。而益生菌是如何提高機(jī)體免疫力是目前研究的熱點(diǎn)之一。目前最常用的益生菌菌株是乳桿菌屬,鼠李糖乳桿菌(LGG)是一種模式益生菌,它可以定植在機(jī)體腸道內(nèi),對(duì)預(yù)防和治療人和動(dòng)物的多種腸道炎癥起關(guān)鍵作用。隨著我國(guó)畜牧業(yè)的不斷發(fā)展與進(jìn)步,仔豬的斷奶日齡也在逐漸的提前。初生仔豬免疫力低下,腸道菌群紊亂都是引發(fā)仔豬腹瀉的原因。T細(xì)胞是機(jī)體免疫功能的重要標(biāo)志,所以,本試驗(yàn)探究了LGG對(duì)仔豬T淋巴細(xì)胞的影響,旨在為研發(fā)基于乳酸菌的動(dòng)物微生態(tài)制劑奠定了理論基礎(chǔ)同時(shí)為預(yù)防仔豬腹瀉開辟了新的思路與途徑。具體的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)本研究選用LGG ATCC53103為實(shí)驗(yàn)菌株。隨機(jī)選取20日齡健康仔豬6頭分為2組,分別為實(shí)驗(yàn)組(LGG組)和對(duì)照組(生理鹽水組),LGG組仔豬每天灌服1mL LGG(6×10~9 CFU/mL)。生理鹽水組仔豬每天灌服1mL生理鹽水。15d時(shí)宰殺仔豬,分別取仔豬的腸系膜淋巴結(jié)(MLN),回腸和派氏淋巴結(jié)(PPs),回腸和空腸固有層(LP)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)以及免疫熒光方法檢測(cè)CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞以及CD4~+CD8~+雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況,將MLN中CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞分選并提取RNA,通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況。結(jié)果表明,MTS淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果顯示LGG組淋巴細(xì)胞增殖情況顯著高于生理鹽水組(P0.001)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示LGG組仔豬MLN中的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞與生理鹽水組相比無(wú)顯著差異(P0.05)。LGG組仔豬空腸,回腸PP中的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞與生理鹽水組相比有顯著差異(P0.05,P0.05)。LGG組仔豬空腸LP中的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞與生理鹽水組相比有顯著差異(P0.05)。LGG組仔豬回腸LP中的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞與生理鹽水組相比有顯著差異(P0.01)。LGG組IEL中CD4~+CD8~+T淋巴細(xì)胞顯著高于生理鹽水組(P0.001)。免疫熒光結(jié)果顯示LGG組仔豬回腸中CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞多于生理鹽水組,PPs中CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞多于生理鹽水組。此外,我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選了仔豬MLN中CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞,通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量,結(jié)果顯示LGG組轉(zhuǎn)錄因子T-bet顯著高于GATA(P0.01)。LGG組Foxp3~+與ROR差異不顯著(P0.05),所以T細(xì)胞趨向Th1分化。綜上所述LGG可以刺激仔豬T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加,并且趨向Th1分化。(2)本研究選用LGG ATCC53103為實(shí)驗(yàn)菌株。隨機(jī)選取健康仔豬12頭隨機(jī)分為2組,分別為實(shí)驗(yàn)組(LGG組)和對(duì)照組(生理鹽水組),LGG組仔豬每天灌服1mL LGG(6×10~9 CFU/mL)。生理鹽水組仔豬每天灌服1mL生理鹽水。分別在30d和45d時(shí)宰殺仔豬,取仔豬的MLN,空腸及回腸PPs,LP。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況,并通過(guò)腸道石蠟切片觀察腸道絨毛發(fā)育情況。結(jié)果表明:30d,45d時(shí)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示LGG組仔豬MLN中的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞與生理鹽水組相比差異顯著(P0.05,P0.01)。LGG組仔豬空腸PP中的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞與生理鹽水組相比有顯著差異(P0.05)。LGG組仔豬回腸PP中的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞與生理鹽水組(相比有顯著差異(P0.05,P0.01)。LGG組仔豬LP中的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞與生理鹽水組相比有顯著差異(P0.001,P0.05)。LGG組仔豬回腸絨毛長(zhǎng)度與生理鹽水組相比差異顯著(P0.01,P0.001)。HE染色結(jié)果顯示LGG組(30d、45d)仔豬回腸絨毛長(zhǎng)度與生理鹽水組(30d、45d)相比差異顯著(P0.01,P0.01)。LGG組(15d、30d、45d)MLN、空腸PP、回腸PP、LP中CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞均無(wú)顯著差異(P0.05)。綜上所述LGG在30d,45d時(shí)同樣可以調(diào)節(jié)早期斷奶仔豬腸道內(nèi)T淋巴細(xì)胞增殖,增加CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞數(shù)量且具有保護(hù)腸道絨毛發(fā)育及完整性的作用。(3)為了分析LGG分泌蛋白P40的免疫學(xué)作用,我們將P40蛋白基因合成,將基因連接到pET28a載體,通過(guò)鎳柱純化出P40蛋白。隨機(jī)選取一頭仔豬,分離LP淋巴細(xì)胞。分別用LGG,P40,T細(xì)胞活化抑制劑(CSA)刺激細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CSA能有效抑制T淋巴細(xì)胞活化。12h,24h,36h LGG組和P40組誘導(dǎo)仔豬淋巴細(xì)胞的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞顯著高于對(duì)照組(P0.001)。在12h,24h,36h LGG+CSA組和P40+CSA組也顯著高于CSA組(P0.05)。LGG與P40組無(wú)明顯差異(P0.05)。由此得知,LGG蛋白P40在調(diào)節(jié)仔豬T淋巴細(xì)胞變化中起主要作用。LGG對(duì)仔豬T淋巴細(xì)胞起到調(diào)節(jié)作用使T淋巴細(xì)胞趨向Th1分化,同時(shí)LGG對(duì)仔豬T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)具有保護(hù)腸道絨毛發(fā)育及完整性的作用,并且LGG分泌的P40蛋白在此過(guò)程中起到了關(guān)鍵性的作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S828.5
【圖文】：

圖 1-1 灌服 LGG 對(duì)仔豬的淋巴細(xì)胞增殖情況（Fig 1.1 Lymphocyte proliferation in LGG at 15仔豬 T 淋巴細(xì)胞數(shù)量影響的結(jié)果 對(duì)仔豬 MLN 中 CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量影響的

圖 1-2 灌服 LGG 的仔豬 MLN 中 CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量（15d）Fig 1-2 The number of CD4+CD8+T lymphocytes in MLN of piglets with LGG at 15d1.3.2.2 LGG 對(duì)仔豬空腸 PPs 中 CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量影響的結(jié)果將仔豬空腸 PPs 單細(xì)胞懸液進(jìn)行抗體染色，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)仔豬空腸 PPs 中 CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化，從圖 1-3 中可知，灌服 LGG 的仔豬

圖 1-3 灌服 LGG 的仔豬空腸 PPs 中 CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量（15d）Fig 1-3 The number of CD3+CD4+T lymphocytes in jejunum PPs of piglets with LGG at 15d1.3.2.3 LGG 對(duì)仔豬回腸 PPs 中 CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量影響的結(jié)果將仔豬回腸 PPs 單細(xì)胞懸液進(jìn)行抗體染色，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)仔豬回

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本文編號(hào)：2759100