發(fā)布時(shí)間：2020-07-17 06:19

【摘要】：骨骼肌是機(jī)體能量調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位,肌肉生長抑制素Myostatin(MSTN)作為一種重要的肌肉生長發(fā)育負(fù)調(diào)控因子,在骨骼肌的生長發(fā)育過程中起著非常關(guān)鍵的作用。大量的研究表明,抑制MSTN基因的表達(dá),不僅僅能夠在生產(chǎn)方面提高畜禽的瘦肉產(chǎn)量,而且可以用于醫(yī)學(xué)方面肌肉萎縮相關(guān)疾病的研究。目前對(duì)于MSTN功能的研究主要依賴于MSTN~(-/-)小鼠模型,本研究利用之前構(gòu)建的MSTN~(-/-)牛模型,采用高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對(duì)MSTN在肌肉生長發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入研究。1.本研究利用TMT-6 plex標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對(duì)MSTN~(-/-)內(nèi)蒙古黑牛和野生型牛的腿臀肌組織中蛋白的表達(dá)豐度變化進(jìn)行了對(duì)比研究。本次質(zhì)譜結(jié)果共鑒定到1,678個(gè)有定量的蛋白,其中發(fā)現(xiàn)72個(gè)蛋白為差異表達(dá)的蛋白(Fold change=1.55;P≤0.05)。通過對(duì)這72個(gè)差異蛋白的功能分析,我們發(fā)現(xiàn)MSTN~(-/-)組中與肌肉發(fā)育相關(guān)的蛋白顯著上調(diào),同時(shí),參與脂代謝、線粒體代謝及呼吸鏈的活性相關(guān)生物學(xué)過程的蛋白也都呈上調(diào)表達(dá)的趨勢。生物信息學(xué)的分析結(jié)果也表明,72個(gè)差異蛋白主要參與脂肪酸代謝、氧化磷酸化過程、PPAR信號(hào)通路、肌肉的生長發(fā)育等代謝調(diào)控通路。2.在蛋白組學(xué)鑒定的同時(shí),我們利用TiO_2技術(shù)對(duì)肽段進(jìn)行富集,對(duì)MSTN~(-/-)牛和野生型牛進(jìn)行了肌肉的磷酸化蛋白組學(xué)研究。最終鑒定到1,777個(gè)磷酸化肽段,這些肽段歸屬于433個(gè)磷酸化蛋白;同樣,在Fold change=1.55,P≤0.05的篩選條件下,我們獲得50個(gè)差異表達(dá)的磷酸化肽段,這些肽段歸屬于36個(gè)蛋白。對(duì)這36個(gè)差異磷酸化蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示差異磷酸化蛋白主要參與肌肉的生長發(fā)育和糖酵解等生物過程。3.綜合蛋白組學(xué)和磷酸化組學(xué)的研究結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)在MSTN~(-/-)牛的肌肉組織中,上調(diào)的差異蛋白主要富集在糖酵解途徑和脂肪酸降解途徑中,結(jié)合肌肉中糖原含量和肌間脂肪含量的測定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)MSTN基因敲除后,不僅能夠通過增強(qiáng)糖酵解途徑加強(qiáng)糖原的分解,而且能夠通過增強(qiáng)線粒體的活性促進(jìn)脂肪酸的β氧化進(jìn)而降低肌間脂肪含量,這兩個(gè)途徑同時(shí)為肌肉的生長發(fā)育提供更多的能量。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn),MSTN~(-/-)是通過提高AMP/ATP的比值激活A(yù)MPK信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)糖代謝和脂代謝的調(diào)控功能,進(jìn)而調(diào)控肌肉的生長發(fā)育和正常的生理活動(dòng)。本研究通過對(duì)MSTN~(-/-)牛與野生牛的肌肉組織進(jìn)行比較蛋白組學(xué)和磷酸化蛋白組學(xué)分析,研究MSTN影響肌肉生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。一方面我們發(fā)現(xiàn)了一系列與MSTN功能相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白;另一方面我們發(fā)現(xiàn)MSTN可以激活A(yù)MPK信號(hào)通路,同時(shí)調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝這兩大代謝通路。本研究結(jié)果不僅為研究MSTN對(duì)肌肉生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),同時(shí)對(duì)醫(yī)學(xué)上關(guān)于糖尿病和肥胖病的研究提供了新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：天津農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.2
【圖文】：

圖 2-1 蛋白組學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)圖Figure 2-1 Experimental design and schematic diagram of the proteomics workflRT-PCR 檢測肌肉組織中的總 RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，檢測部分基因在 mR平上的表達(dá)量差異。按照 Trizol 的試劑說明書進(jìn)行總 RNA 的提op ND 2000c 檢測提取的總 RNA 的濃度，用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢總 RNA 的主要步驟為：從超低溫冷凍冰箱中取出適量的肌肉組織液氮將組織研磨成粉末狀。將粉狀物置于加有 1mL Trizol 裂解液的中，并搖勻。再加入0.2mL氯仿，搖勻震蕩后在4℃離心機(jī)中離心15m吸取上清至新管中，再加入 2 倍上清體積的異丙醇，混勻，繼續(xù) 4℃離0 r/min）。這次要棄掉上清，留下沉淀物，用 1mL DEPC 水配制的 7，再次 4℃離心 5min（7,500 r/min）。棄上清，用 20μL 的 DEPC 水

天津農(nóng)學(xué)院碩士學(xué)位論文圖 2-3 所示，全蛋白分布均勻，可供后續(xù)分析使用。圖2-3 考馬斯亮藍(lán)染色法定性肌肉蛋白提取結(jié)果：T1, T2, T3分別代表3頭轉(zhuǎn)基因組牛；C1, C2,C3 分別為 3 頭非轉(zhuǎn)基因牛；M 代表 marker。Figure 2-3 Coomassie brilliant blue staining method for qualitative muscle protein extraction. T1,T2, T3 represent the three transgenic cattle, C1, C2, C3 represent the three wild-typecattle and the M represent the marker.2.2.2 蛋白組學(xué)鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析利用蛋白組學(xué)技術(shù)，本研究在內(nèi)蒙古黑牛的腿臀肌組織中共鑒定到 1,666 個(gè)有定量的蛋白，每種蛋白至少包含一條獨(dú)特的肽段。以 MSTN-/-組比對(duì)照組的變化倍數(shù)作為篩選差異蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，通過 Persurs 軟件進(jìn)行 t 檢驗(yàn)和差異倍數(shù)的篩選。首先，對(duì) 9 列數(shù)據(jù)進(jìn)行單樣本 t 檢驗(yàn)，通過 t 檢驗(yàn)的蛋白個(gè)數(shù)有 588 個(gè)，即 MSTN-/-組與對(duì)照組相比，肌肉組織中有 588 個(gè)蛋白的表達(dá)是有差異的。然后設(shè)置差異倍數(shù)

圖 2-4 蛋白組學(xué)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Figure 2-4 The result of proteomic analysis生物信息學(xué)分析結(jié)果蛋白的功能分析，可將 72 個(gè)差異蛋白分為 4 大類（圖 2相關(guān)的蛋白約占總數(shù)的 22%，與轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白占 17占 14%，與脂代謝相關(guān)的蛋白占 11%，其余的蛋白功能（見附表 1）。通過觀察發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的 54 個(gè)蛋白幾乎都分蛋白多屬于雜蛋白，彼此之間的關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)。據(jù)此，我們古黑牛肌肉組織的脂代謝和線粒體活性的調(diào)節(jié)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 姜衛(wèi)紅,PattersonJohnA;乙酸菌糖磷酸化作用的研究[J];微生物學(xué)報(bào);1999年06期

本文編號(hào)：2759089