【摘要】：口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是造成畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)嚴(yán)重?fù)p失的傳染病之一,FMD的爆發(fā)不僅嚴(yán)重降低了畜群的生產(chǎn)力,還影響易感動物及其產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易。目前,已開發(fā)多種ELISA方法廣泛用于檢測畜群口蹄疫病毒抗體。但是,基于不同形式和抗原類型的ELISA方法存在抗原制備困難,病毒擴(kuò)散風(fēng)險高、假陽性高、敏感性較低及操作復(fù)雜等不同的缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí),O型FMD病毒樣顆粒(VLPs)類似天然的口蹄疫病毒、能誘導(dǎo)機(jī)體免疫性保護(hù)、易于制備且不受生物安全設(shè)施的限制、安全性高。因此,本研究以O(shè)型FMD VLPs作為診斷抗原,建立競爭ELISA方法檢測O型口蹄疫病毒抗體,以期為FMD檢疫和防控提供技術(shù)手段。本研究經(jīng)原核表達(dá)、純化及組裝制備O型FMD VLPs,將所得目的蛋白分別進(jìn)行SDS-PAGE、DLS、TEM及Western blot試驗(yàn)鑒定,并測定其蛋白濃度;以試驗(yàn)所得O型FMD VLPs為抗原免疫家兔制備高免血清,并通過飽和硫酸銨沉淀法、Protein A親和層析法及過碘酸鈉法,對高免血清中的IgG進(jìn)行純化和標(biāo)記,得到HRP-IgG后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot試驗(yàn)鑒定及ELISA方法測定其效價;以O(shè)型FMD VLPs作為診斷抗原建立競爭ELISA方法,試驗(yàn)通過棋盤交叉滴定法、方陣滴定法及繪制ROC曲線等方法確定了競爭ELISA方法最佳試驗(yàn)條件及判斷標(biāo)準(zhǔn),組裝試劑盒并進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn),特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、符合率試驗(yàn)、批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)及37℃加速保存試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如下:原核表達(dá)、純化及組裝成功獲得O型FMD VLPs,其粒徑大小基本聚集在20 nm~50 nm之間,與天然FMDV顆粒大小相似,其可與O型FMDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),測定其濃度為836.7μg/mL;以O(shè)型FMD VLPs為抗原免疫家兔,成功制備高免血清。純化和標(biāo)記高免血清中的IgG,成功獲得HRP-IgG,測定HRP-IgG抗體滴度大于1:640 000,且HRP-IgG可與O型FMD VLPs特異性結(jié)合;競爭ELISA方法的最佳試驗(yàn)條件及判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:抗原包被濃度為0.5μg/mL,血清稀釋度為1:4,酶標(biāo)抗體稀釋度為1:18 000,抗原包被條件為4℃過夜或37℃2.5 h,封閉液為1%BSA,封閉液作用條件為37℃30 min,血清和酶標(biāo)抗體作用條件為37℃30 min,底物作用條件為37℃10 min,臨界值設(shè)定為PI=50%,即PI50%判為陰性血清,當(dāng)PI"g50%判為陽性血清。通過不同試驗(yàn)證實(shí)該檢測方法無交叉反應(yīng),敏感性為96%,特異性為100%,批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于15%,與LPB-ELISA試劑盒、VDpro~?ELISA試劑盒及PrioCHEK~?ELISA試劑盒的符合率分別是97%、99%及97%;37℃加速保存試驗(yàn)顯示試劑盒能在37℃條件下保存至少7天。本研究成功建立用于O型口蹄疫病毒抗體檢測的競爭ELISA方法并組裝試劑盒,并證實(shí)該檢測方法具有敏感、特異、簡單及穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),可為FMD防控提供更好的檢測技術(shù),并具有良好的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

TMB，每孔 50 μL，37℃顯色 15 min。液，每孔 50 μL 混勻，酶標(biāo)儀上讀取樣品 OD450 nm 測定 OD450 nm/陰性血清 OD450 nm），測定 HRP-IgPs 表達(dá)及純化鑒定結(jié)果驗(yàn)結(jié)果化及組裝后得到目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)鑒定及組裝后得到目的蛋白條帶大小與 O 型 FMD VL組裝成功獲得 O 型 FMD VLPs（由 VP0、VP1、白純度較高，雜蛋白較少，符合本試驗(yàn)要求。

第二章 O 型口蹄疫病毒樣顆粒原核表達(dá)、純化及高免血清的制備.2 動態(tài)光散射試驗(yàn)（DLS）結(jié)果將上述體外組裝后所得目的蛋白進(jìn)行 DLS 試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖 2-2。試驗(yàn)結(jié)果裝的目的蛋白粒徑大小基本聚集在 20 nm~50 nm 之間，顆粒具有良好的均一性范圍內(nèi)的蛋白量占總蛋白量的 97.2%。說明 O 型 FMDV 的 3 種結(jié)構(gòu)蛋白在體外功組裝成 O 型 FMD VLPs。

圖 2-2 納米粒度儀測定 O 型 FMD VLPs 粒徑大小Fig 2-2 Size of O-type FMD VLPs measured by DLS試驗(yàn)（TEM）結(jié)果組裝后所得目的蛋白進(jìn)行 TEM 試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖 2-3。蛋白粒徑大小同樣聚集在 20 nm~50 nm 之間，顆粒呈圓形。TEM 進(jìn)一步證實(shí) O 型 FMDV 的 3 種結(jié)構(gòu)蛋白在體外組LPs。

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本文編號：2759066