【摘要】：傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性、致死性疾病,主要攻擊禽類重要的中樞免疫器官法氏囊,能夠引起免疫抑制進而導致嚴重的繼發(fā)感染,最終造成雞的死亡,危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。疫苗是防控該病的有效方法,傳統(tǒng)的疫苗存在一些難以避免的缺點,弱毒苗的廣泛使用易導致毒株突變,而強毒滅活苗存在滅活不徹底等生物安全隱患。近年興起的病毒樣顆粒(VLP)等亞單位疫苗能克服上述缺點,誘導機體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。目前很多雞場也采用卵黃抗體緊急治療IBD發(fā)病雞群,在一定程度上降低了經(jīng)濟損失。卵黃抗體雖然制備方式簡單,但是具有純度差和抗體滴度低等缺點,采用基因工程方法制備高純度的治療性抗體是病毒性疾病治療的發(fā)展趨勢。VP2是IBDV唯一的衣殼蛋白,位于病毒衣殼的外部,能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體,決定IBDV的抗原性,是制備VLP疫苗的重要靶標。然而IBDV強、弱毒VP2誘導免疫反應(yīng)存在差異,為篩選更有效的IBDV VLP候選疫苗,本研究在IBDV超強毒株Gx株VLP制備的基礎(chǔ)上,擴增IBDV人工致弱毒株Gt株的VP2基因序列,將其克隆在酵母表達載體pAO815上構(gòu)建成pAO815-NHisGtVP2質(zhì)粒,將其電轉(zhuǎn)至酵母菌株SMD1168后,經(jīng)過5天的誘導表達,成功表達了Gt VP2蛋白。通過疏水層析純化的方法制備了純度高的弱毒VLP,建立了更高效的VLP制備方法。瓊脂擴散試驗結(jié)果表明制備的Gt VLP具有良好的抗原性。將Gx和Gt VLP免疫SPF雞,比較評價了二者對IBDV超強毒的免疫保護效果。強、弱毒VLP免疫組血清中和抗體滴度在免疫5周內(nèi)始終維持在較高的水平,表明二者均能誘導產(chǎn)生持續(xù)的免疫反應(yīng)。強毒VLP免疫組能夠產(chǎn)生100%的攻毒保護率,攻毒后法氏囊狀態(tài)良好。而弱毒VLP免疫組能夠產(chǎn)生80%的攻毒保護率,攻毒后雞的法氏囊萎縮明顯。這些結(jié)果表明,免疫強毒VLP比免疫弱毒VLP對雞群抵抗IBDV超強毒株具有更好的保護效果。噬菌體展示技術(shù)是篩選抗體的有效技術(shù)手段,為了篩選有效的IBD治療性抗體,本研究從免疫過Gx VLP的雞全血中分離外周血淋巴細胞,從中擴增出抗體的輕鏈可變區(qū)(VL區(qū))與重鏈可變區(qū)(VH區(qū)),通過柔性Linker將二者連接。將其克隆進噬菌粒構(gòu)建了pCANTAB5E-scFv質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化之后建立了雞源噬菌體抗IBDV抗體文庫。通過三輪的淘選富集以及ELISA鑒定,最終測序得到了5株陽性抗體序列。表達純化后的單鏈抗體的中和活性有待進一步驗證。本研究比較了強、弱毒病毒樣顆粒的免疫保護效果,為臨床上亞單位疫苗的研究和應(yīng)用提供了一定的參考依據(jù),建立了噬菌體抗IBDV抗體文庫并篩選到了5株抗體序列,為IBDV高效抗體的篩選與表達奠定了基礎(chǔ),這些研究對IBDV的防控具有重要意義。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4
【圖文】：

中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言構(gòu)的構(gòu)成，更可能的是具有調(diào)控功能，可能在病毒的調(diào)節(jié)和釋放過程中起到重要的作用。在所有的血清Ⅰ型 IBDV 菌株中，VP5 堿性較高、保守并富含半胱氨酸。VP5 在誘導法氏囊產(chǎn)生病理現(xiàn)象中起到了重要的作用（Yao et al., 1998）。VP5 在細胞膜內(nèi)釋放降低了細胞的存活能力，VP2 和VP5 已被證實能夠誘導體外培養(yǎng)細胞的凋亡（Rodriguez et al., 2005 ;Yao et al., 1998）。

中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第二章 弱毒株 VP2 病毒樣顆粒的表達與制備化后電鏡觀察圖片（圖 2-4 B）顯示，純化前雜蛋白較多，且形態(tài)不好，純化后形成形態(tài)較好的直徑 20 nm 的 VLP 顆粒，表明通過 VP2 通過自組裝形成了 VLP 結(jié)構(gòu)。A: SDS-PAGE; B: western blotM：Protein Maker A1-A8: Protein products that are received sequentially.M:蛋白分子量標準; A1-A8:純化時收集的蛋白樣品圖 2-3 疏水層析純化 SDS-PAGE（A）、Western blot(B)Fig.2-3 Hydrophobic Chromatography of SDS-PAGE（A）、Western blot(B)A BM A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8100KD70KD55KD40KD35KDA1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8A B

-5 瓊脂擴散（AGP）試驗鑒定 GtVP2的病毒樣顆粒的抗原性f antigenicity of virus-like particles whic性的疾病，主要侵害雞的法氏囊衣殼蛋白 VP2 蛋白已經(jīng)在大腸桿hen et al., 2005;Dey et al., 2009）。表達系統(tǒng)能夠表達出空間構(gòu)象較酵母表達系統(tǒng)對于解決蛋白的不其是對于病毒衣殼蛋白和囊膜蛋操作簡單的特點（Valenzuela et等修飾作用。因此，相對于原核白，所以該系統(tǒng)在成功表達并修D(zhuǎn)V 的衣殼蛋白 VP2，成功獲得了細胞等表達體系表達的單體 VP

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2759056