【摘要】：傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性、致死性疾病,主要攻擊禽類(lèi)重要的中樞免疫器官法氏囊,能夠引起免疫抑制進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的繼發(fā)感染,最終造成雞的死亡,危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。疫苗是防控該病的有效方法,傳統(tǒng)的疫苗存在一些難以避免的缺點(diǎn),弱毒苗的廣泛使用易導(dǎo)致毒株突變,而強(qiáng)毒滅活苗存在滅活不徹底等生物安全隱患。近年興起的病毒樣顆粒(VLP)等亞單位疫苗能克服上述缺點(diǎn),誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。目前很多雞場(chǎng)也采用卵黃抗體緊急治療IBD發(fā)病雞群,在一定程度上降低了經(jīng)濟(jì)損失。卵黃抗體雖然制備方式簡(jiǎn)單,但是具有純度差和抗體滴度低等缺點(diǎn),采用基因工程方法制備高純度的治療性抗體是病毒性疾病治療的發(fā)展趨勢(shì)。VP2是IBDV唯一的衣殼蛋白,位于病毒衣殼的外部,能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,決定IBDV的抗原性,是制備VLP疫苗的重要靶標(biāo)。然而IBDV強(qiáng)、弱毒VP2誘導(dǎo)免疫反應(yīng)存在差異,為篩選更有效的IBDV VLP候選疫苗,本研究在IBDV超強(qiáng)毒株Gx株VLP制備的基礎(chǔ)上,擴(kuò)增IBDV人工致弱毒株Gt株的VP2基因序列,將其克隆在酵母表達(dá)載體pAO815上構(gòu)建成pAO815-NHisGtVP2質(zhì)粒,將其電轉(zhuǎn)至酵母菌株SMD1168后,經(jīng)過(guò)5天的誘導(dǎo)表達(dá),成功表達(dá)了Gt VP2蛋白。通過(guò)疏水層析純化的方法制備了純度高的弱毒VLP,建立了更高效的VLP制備方法。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果表明制備的Gt VLP具有良好的抗原性。將Gx和Gt VLP免疫SPF雞,比較評(píng)價(jià)了二者對(duì)IBDV超強(qiáng)毒的免疫保護(hù)效果。強(qiáng)、弱毒VLP免疫組血清中和抗體滴度在免疫5周內(nèi)始終維持在較高的水平,表明二者均能誘導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)的免疫反應(yīng)。強(qiáng)毒VLP免疫組能夠產(chǎn)生100%的攻毒保護(hù)率,攻毒后法氏囊狀態(tài)良好。而弱毒VLP免疫組能夠產(chǎn)生80%的攻毒保護(hù)率,攻毒后雞的法氏囊萎縮明顯。這些結(jié)果表明,免疫強(qiáng)毒VLP比免疫弱毒VLP對(duì)雞群抵抗IBDV超強(qiáng)毒株具有更好的保護(hù)效果。噬菌體展示技術(shù)是篩選抗體的有效技術(shù)手段,為了篩選有效的IBD治療性抗體,本研究從免疫過(guò)Gx VLP的雞全血中分離外周血淋巴細(xì)胞,從中擴(kuò)增出抗體的輕鏈可變區(qū)(VL區(qū))與重鏈可變區(qū)(VH區(qū)),通過(guò)柔性Linker將二者連接。將其克隆進(jìn)噬菌粒構(gòu)建了pCANTAB5E-scFv質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化之后建立了雞源噬菌體抗IBDV抗體文庫(kù)。通過(guò)三輪的淘選富集以及ELISA鑒定,最終測(cè)序得到了5株陽(yáng)性抗體序列。表達(dá)純化后的單鏈抗體的中和活性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究比較了強(qiáng)、弱毒病毒樣顆粒的免疫保護(hù)效果,為臨床上亞單位疫苗的研究和應(yīng)用提供了一定的參考依據(jù),建立了噬菌體抗IBDV抗體文庫(kù)并篩選到了5株抗體序列,為IBDV高效抗體的篩選與表達(dá)奠定了基礎(chǔ),這些研究對(duì)IBDV的防控具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4
【圖文】：

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言構(gòu)的構(gòu)成，更可能的是具有調(diào)控功能，可能在病毒的調(diào)節(jié)和釋放過(guò)程中起到重要的作用。在所有的血清Ⅰ型 IBDV 菌株中，VP5 堿性較高、保守并富含半胱氨酸。VP5 在誘導(dǎo)法氏囊產(chǎn)生病理現(xiàn)象中起到了重要的作用（Yao et al., 1998）。VP5 在細(xì)胞膜內(nèi)釋放降低了細(xì)胞的存活能力，VP2 和VP5 已被證實(shí)能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡（Rodriguez et al., 2005 ;Yao et al., 1998）。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 弱毒株 VP2 病毒樣顆粒的表達(dá)與制備化后電鏡觀察圖片（圖 2-4 B）顯示，純化前雜蛋白較多，且形態(tài)不好，純化后形成形態(tài)較好的直徑 20 nm 的 VLP 顆粒，表明通過(guò) VP2 通過(guò)自組裝形成了 VLP 結(jié)構(gòu)。A: SDS-PAGE; B: western blotM：Protein Maker A1-A8: Protein products that are received sequentially.M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); A1-A8:純化時(shí)收集的蛋白樣品圖 2-3 疏水層析純化 SDS-PAGE（A）、Western blot(B)Fig.2-3 Hydrophobic Chromatography of SDS-PAGE（A）、Western blot(B)A BM A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8100KD70KD55KD40KD35KDA1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8A B

-5 瓊脂擴(kuò)散（AGP）試驗(yàn)鑒定 GtVP2的病毒樣顆粒的抗原性f antigenicity of virus-like particles whic性的疾病，主要侵害雞的法氏囊衣殼蛋白 VP2 蛋白已經(jīng)在大腸桿hen et al., 2005;Dey et al., 2009）。表達(dá)系統(tǒng)能夠表達(dá)出空間構(gòu)象較酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于解決蛋白的不其是對(duì)于病毒衣殼蛋白和囊膜蛋操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)（Valenzuela et等修飾作用。因此，相對(duì)于原核白，所以該系統(tǒng)在成功表達(dá)并修D(zhuǎn)V 的衣殼蛋白 VP2，成功獲得了細(xì)胞等表達(dá)體系表達(dá)的單體 VP

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號(hào)：2759056