【摘要】：研究背景:布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)是一種嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的人獸共患病,動(dòng)物布病主要依賴疫苗免疫來(lái)預(yù)防和控制。目前,國(guó)內(nèi)疫苗株主要有3種,分別是S2(主要用于豬布魯氏防疫)、A19(用于牛布魯氏防疫)、M5-90(用于綿羊布魯氏防疫)。這些疫苗在預(yù)防和控制動(dòng)物布魯氏菌傳播中發(fā)揮了重要作用。在這些疫苗的實(shí)際應(yīng)用中,也存在一些問(wèn)題。而血清學(xué)監(jiān)測(cè)是動(dòng)物布病診斷最主要的技術(shù)手段,主要有常用的虎紅平板凝集、試管凝集等方法,但是這些方法無(wú)法區(qū)分哪些是自然感染抗體,哪些是免疫抗體,給防疫工作的開(kāi)展帶來(lái)很大困難。基因標(biāo)記疫苗被認(rèn)為是解決布病疫苗免疫與自然感染鑒別診斷難題的新型疫苗形式。由天康生物股份有限公司研發(fā)的A19-ΔVirB12基因標(biāo)記疫苗,其毒力與母本株相比降低,具有良好的保護(hù)作用。利用VirB12蛋白能夠進(jìn)行血清學(xué)診斷。本研究旨在通過(guò)體外重組表達(dá)VirB12蛋白,分析VirB12蛋白的細(xì)胞免疫特性,并探討其在疫苗免疫與自然感染中鑒別的可行性。研究方法:提取細(xì)菌基因組DNA,根據(jù)NCBI上登錄的布魯氏菌A19菌株virB12基因序列,使用分子生物學(xué)軟件prime premier 5.0設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)擴(kuò)增virB12基因的引物。利用PCR方法擴(kuò)增出virB12基因,并克隆到pET-28a質(zhì)粒載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化,并對(duì)純化后的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡鑒定。布魯氏菌A19-ΔVirB12菌株與親本株布魯氏菌A19株及牛種強(qiáng)毒2308株相比缺少了virB12基因,A19-ΔVirB12菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中不表達(dá)對(duì)應(yīng)的VirB12蛋白,動(dòng)物在免疫接種后無(wú)法產(chǎn)生VirB12抗體及對(duì)應(yīng)的免疫記憶,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外提取A19菌株和A19-ΔVirB12菌株免疫后試驗(yàn)動(dòng)物的外周血淋巴細(xì)胞,培養(yǎng)后用VirB12蛋白作為抗原刺激淋巴細(xì)胞,然后檢測(cè)IFN-γ,對(duì)A19菌株和A19-ΔVirB12菌株進(jìn)行免疫鑒別。研究結(jié)果:本試驗(yàn)成功構(gòu)建了布魯氏菌A19菌株virB12基因的原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)的VirB12蛋白經(jīng)純化后獲得了純度較高的重組蛋白,免疫印記試驗(yàn)顯示該重組蛋白有較好的反應(yīng)原性,與布魯氏菌野毒陽(yáng)性血清有反應(yīng),與A19-ΔVirB12菌株免疫血清無(wú)反應(yīng)。采用純化的VirB12蛋白進(jìn)行的體外IFN-γ檢測(cè),結(jié)果顯示,A19菌株免疫組與A19-ΔVirB12菌株免疫組的外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)經(jīng)VirB12刺激后產(chǎn)生的IFN-γ存在顯著差異(P0.001),表明通過(guò)這種體外PBMC細(xì)胞提取及VirB12蛋白刺激可以鑒別區(qū)分A19菌株與A19-ΔVirB12菌株免疫。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了VirB12蛋白的原核表達(dá)菌株,經(jīng)純化后的VirB12蛋白可以作為刺激抗原,在體外IFN-γ水平上可實(shí)現(xiàn)對(duì)A19菌株免疫與A19-ΔVirB12菌株免疫進(jìn)行區(qū)分,為布氏菌病的防控及凈化提供新的方法和思路。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61
【圖文】：

放置在搖床上，用 TBST 清洗毒感染牛的陽(yáng)性血清和 A19-ΔVirB1箱孵育 1 h，取出后，按上述方法繼HRP 標(biāo)記的蛋白 G 作為二抗也加入抗相同。最后向放于小平皿中的 NC暗室顯色，發(fā)現(xiàn)條帶后用脫色液沖洗％瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，500bp目的片段 519bp 相符（圖 1）。此結(jié)

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文：DL5000；1：陰性對(duì)照；2~3:PCR 擴(kuò)Figure 1 PCR amplification of virB12 g；1:Negative control；2~3：Amplificati的鑒定 pET-28a 質(zhì)粒經(jīng) BamHⅠ和 SalⅠ雙酶菌 BL21（DE3）于 37℃恒溫箱培 BamHⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定。結(jié)果顯p 的特異性條帶（圖 2），說(shuō)明布魯菌落為陽(yáng)性克隆。然后將質(zhì)粒送寶氏菌 A19 菌株 virB12 基因序列。

圖 3 virB12 基因測(cè)序結(jié)果分析Figure 3 Analysis of virB12 sequencing results的誘導(dǎo)表達(dá)和 SDS-PAGE 電泳鑒定VirB12 重組表達(dá)菌接種于 4mL 含 Kan(50μg/mL）的當(dāng)其 OD600約為 0.4～0.6 時(shí)，加入 IPTG 至終濃度離心收集菌體沉淀。在收集的菌體沉淀中加入 SDS勻后煮沸裂解 10 分鐘，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳。SD測(cè)到大小約為 22KDa 蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期一致表達(dá)（圖 4）。

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本文編號(hào)：2755554