【摘要】：內(nèi)脂素(Visfatin)作為一種新型蛋白同時(shí)也是一種多功能蛋白,具有和前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子(PBEF)相同的蛋白結(jié)構(gòu),與煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)有同樣的酶活性,能通過調(diào)節(jié)氧化型輔酶l(NAD)的生成參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程,并且參與免疫和炎癥的調(diào)節(jié)。腸黏膜屏障是機(jī)體防御外界病原微生物入侵的第一道防線,在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明,腸黏膜炎癥疾病中有大量?jī)?nèi)脂素的表達(dá),推測(cè)內(nèi)脂素作為炎性介質(zhì)可能參與腸黏膜損傷的過程,從而影響腸黏膜屏障。因此,本試驗(yàn)首先選用昆明小鼠,腹腔注射LPS誘導(dǎo)腸黏膜損傷,采用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot和ELISA等技術(shù)方法研究?jī)?nèi)脂素在LPS引起的腸黏膜損傷中的作用及參與的信號(hào)通路;其次,通過沉默TLR4、TLR2或IL-1R1等基因研究其對(duì)體外免疫炎癥反應(yīng)中內(nèi)脂素表達(dá)的影響,探討內(nèi)脂素參與免疫炎癥反應(yīng)的應(yīng)答方式,以明確內(nèi)脂素在LPS介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制。具體研究結(jié)果如下:1腸黏膜損傷對(duì)小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)以及內(nèi)脂素表達(dá)的影響本試驗(yàn)取LPS誘導(dǎo)小鼠腸黏膜損傷后淋巴組織較多的回腸作為試驗(yàn)材料,HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組(生理鹽水組)小鼠回腸結(jié)構(gòu)完整,腸絨毛長(zhǎng)度較長(zhǎng),V/C值(小腸消化吸收功能和機(jī)體健康狀況的重要指標(biāo))大;與對(duì)照組相比,LPS組回腸組織損傷明顯,杯狀細(xì)胞增加,腸絨毛固有層水腫,漿膜層結(jié)構(gòu)疏松,黏膜下層疏松,可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),V/C值明顯降低。免疫組化和q-PCR結(jié)果顯示:對(duì)照組小鼠內(nèi)脂素主要表達(dá)在腸隱窩,部分在腸絨毛固有層;LPS組的回腸中,內(nèi)脂素主要在腸隱窩分布,并且在腸絨毛固有層中的分布增加,內(nèi)脂素的轉(zhuǎn)錄水平明顯增強(qiáng)(P0.001)。以上結(jié)果說明,LPS刺激可以破壞回腸結(jié)構(gòu),腸黏膜損傷,影響腸道消化吸收能力,促進(jìn)內(nèi)脂素表達(dá)。2內(nèi)脂素對(duì)腸黏膜損傷中回腸腸黏膜屏障的影響ZO-1、sIgA、Claudin-1和VEGF作為腸黏膜屏障的重要組分,在腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)的完整和功能的發(fā)揮上有關(guān)鍵作用。緊密連接蛋白包括ZO-1和Claudin-1。ZO-1主要分布在腸絨毛上皮細(xì)胞,表達(dá)量多,少量表達(dá)在腸隱窩,在LPS刺激后,表達(dá)明顯減少(P0.01),與LPS組相比,LPS+Visfatin組ZO-1的mRNA和蛋白的表達(dá)均增加。q-PCR檢測(cè)LPS組Claudin-1的表達(dá)比對(duì)照組顯著多(P0.001),與LPS組相比,LPS+Visfatin組Claudin-1表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P0.001)。分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)可維持腸黏膜屏障的穩(wěn)定。sIgA主要分布在腸腺及腸黏膜固有層,表達(dá)量高,LPS作用后的腸黏膜損傷組的sIgA在腸絨毛固有層減少明顯,表達(dá)量明顯減少,與LPS組相比,LPS+Visfatin組表達(dá)量上升明顯,且差異極顯著(P0.01)。VEGF主要表達(dá)在腸隱窩,腸絨毛固有層的中央乳糜管少量分布,表達(dá)水平低,而LPS組VEGF的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.0001);與LPS組相比,LPS+Visfatin組回腸中VEGF在腸絨毛的表達(dá)明顯減少(P0.05)。以上結(jié)果表明,LPS刺激后顯著抑制回腸ZO-1和sIgA表達(dá),上調(diào)Claudin-1和VEGF,破壞腸黏膜屏障造成腸黏膜損傷,而外源性內(nèi)脂素能促進(jìn)ZO-1和sIgA表達(dá),下調(diào)Claudin-1和VEGF,降低腸黏膜屏障的破壞程度。3內(nèi)脂素對(duì)腸黏膜損傷中相關(guān)信號(hào)通路的影響通過對(duì)前期RNA-seq的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)IκBα、TLR8、TICAM-1和NOD2等基因與腸黏膜免疫相關(guān)并且富集在TLR信號(hào)通路及NLR信號(hào)通路。因此,本試驗(yàn)選取了TLR信號(hào)通路和NLR信號(hào)通路以及抗原呈遞信號(hào)通路中四個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,兩個(gè)關(guān)鍵因子進(jìn)行蛋白水平檢驗(yàn)。結(jié)果顯示TLR4在LPS組比對(duì)照組明顯增加(P0.0001),與LPS組比較,LPS+Visfatin組顯著下降(P0.05)。TICAM-1和IκBα的表達(dá)變化TLR4一致。H2-Q10在Saline組、LPS組和LPS+Visfatin組保持上升趨勢(shì),H2-Q10在LPS組明顯高于Saline組(P0.01)。Western Blot技術(shù)和ELISA結(jié)果顯示:與Saline組比,NOD2在LPS組表達(dá)上升,跟LPS組比,LPS+Visfatin組NOD2下降;TLR8的變化趨勢(shì)與NOD2一致。表明:LPS作用后,激活天然免疫信號(hào)通路,促進(jìn)炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)腸黏膜損傷;內(nèi)脂素的添加抑制了TLR4、TICAM-1、IκBα、NOD2和TLR8的高表達(dá),能參與TLR和NLR信號(hào)通路的調(diào)節(jié),其中主要通過TLR4的調(diào)節(jié),參與TLR信號(hào)通路,降低回腸炎癥反應(yīng),維持腸道穩(wěn)態(tài)。4 TLR4、TLR2和IL-1R1基因沉默對(duì)體外炎癥反應(yīng)中內(nèi)脂素的影響本試驗(yàn)首先利用RNA干擾技術(shù)探究TLR4、TLR2和IL-1R1對(duì)內(nèi)脂素表達(dá)的影響,通過q-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TLR4-230、TLR2-519和IL1R1-1904可作為沉默TLR4、TLR2和IL-1R1基因表達(dá)的最佳干擾序列,siRNA作用濃度為45nM,LPS作用濃度為500ng/ml時(shí),與ControlsiRNA+LPS組比,TLR4siRNA+LPS組、TLR2siRNA+LPS組以及IL-1R1siRNA+LPS組內(nèi)脂素的表達(dá)均下調(diào)(P0.01),此外,還檢測(cè)了TLR4、TLR2和IL-1R1siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24h后,LPS分別處理3h,6h和12h后,內(nèi)脂素表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:LPS刺激6h和12h,與ControlsiRNA+LPS組相比,TLR2siRNA+LPS組和IL-1R1siRNA+LPS組內(nèi)脂素均降低,且差異顯著(P0.05),而TLR4siRNA+LPS組的內(nèi)脂素的表達(dá)有下降趨勢(shì),但是差異不顯著(P0.05)。結(jié)果表明,LPS刺激后能通過調(diào)控TLR4、TLR2和IL-1R1的表達(dá)從而影響內(nèi)脂素的表達(dá),其中TLR2和IL-1R1對(duì)內(nèi)脂素表達(dá)調(diào)控起主要作用,提示先天免疫系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)細(xì)胞中內(nèi)脂素的表達(dá)具有強(qiáng)調(diào)節(jié)作用。5 TLR4、TLR2和IL1R1基因沉默對(duì)各炎癥因子表達(dá)的影響siRNA轉(zhuǎn)染后,LPS刺激RAW264.7細(xì)胞3h、6h和12h,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基上清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的表達(dá)。結(jié)果顯示:與ControlsiRNA+LPS組相比,TLR4siRNA+LPS、TLR2siRNA+LPS和IL-1R1siRNA+LPS組的TNF-α和IL-6、IL-1β和MCP-1的蛋白水平顯著下降,其中TLR4siRNA、TLR2siRNA和IL-1R1siRNA在LPS刺激6h時(shí)均下調(diào)TNF-α,差異極顯著(P0.01),在LPS刺激12h時(shí)均顯著下調(diào)IL-6的表達(dá)(P0.01),LPS作用6h以及12h均能下調(diào)IL-1β(P0.05),在LPS刺激3h時(shí)極顯著的下調(diào)MCP-1表達(dá)(P0.01)。而TLR2siRNA和IL-1R1siRNA在LPS刺激6h和12h時(shí),同樣抑制內(nèi)脂素的表達(dá),且差異顯著(P0.05)。以上結(jié)果說明,LPS刺激時(shí),沉默TLR4、TLR2和IL-1R1同樣會(huì)引起炎癥因子的表達(dá)下降,進(jìn)一步說明LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中,內(nèi)脂素的表達(dá)與TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子表達(dá)有關(guān),通過調(diào)控上述因子的表達(dá)來參與應(yīng)答反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.3
【圖文】：

誘導(dǎo)的死亡(Pillai et al 2005)。NAD 的增加對(duì)軸突病變和神經(jīng)變性為特征的疾病可以作為靶標(biāo)(Araki et al 2004)，意味著內(nèi)脂素的適度表達(dá)也應(yīng)具有強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用。內(nèi)脂素發(fā)揮胰島素樣的作用，脂肪組織中內(nèi)脂素基因的表達(dá)與促炎基因和代謝表型的具有重要關(guān)聯(lián)。有研究表明，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，內(nèi)脂素與胰島素受體結(jié)合并激活胰島素受體，能夠發(fā)揮與胰島素相同的作用，下調(diào)小鼠的血糖水平， 因此深入研究?jī)?nèi)脂素生理功能可能會(huì)對(duì)血糖穩(wěn)態(tài)或代謝紊亂的新療法開辟新的思路(Fukuhara et al 2005)。而后又發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪組織（VAT）和皮下脂肪組織（SAT）中內(nèi)脂素的 mRNA 水平與血糖濃度呈正相關(guān)，測(cè)量數(shù)據(jù)分別為 r = 0.42，P = 0.03 和r = 0.44，P = 0.03(Chang et al 2010)。說明內(nèi)脂素不僅參與血糖調(diào)節(jié)，還與血糖濃度呈正相關(guān)。另一方面，內(nèi)臟脂肪組織的內(nèi)脂素轉(zhuǎn)錄水平與甘油三酯（r = 0.42，P =0.002）和總膽固醇水平（r = 0.37，P = .009）呈正相關(guān)，提示內(nèi)脂素參與脂肪代謝(Chang et al 2010)。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文2 結(jié)果2.1 LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對(duì)小鼠回腸結(jié)構(gòu)的影響2.1.1 LPS 致小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)的病理學(xué)變化HE 染色結(jié)果顯示，生理鹽水對(duì)照組小鼠回腸結(jié)構(gòu)完整、清晰，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無水腫，腸絨毛長(zhǎng)度較長(zhǎng)；LPS 組回腸組織損傷明顯，腸絨毛長(zhǎng)度降低，腸絨毛固有層水腫，黏膜下層疏松，漿膜層結(jié)構(gòu)疏松，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。腸絨毛長(zhǎng)度和腸隱窩深度的比值（V/C 值）采用 IPP 軟件測(cè)量各試驗(yàn)組回腸腸絨毛長(zhǎng)度（V）和腸隱窩深度（C），計(jì)算 V/C 值，結(jié)果顯示，在生理鹽水對(duì)照組小鼠回腸的 V/C值較大，與生理鹽水對(duì)照組相比，LPS 組的 V/C 值降低，差異極顯著（P<0.001）。

圖 2. 不同組小鼠回腸內(nèi)脂素的表達(dá)Fig. 2. The expression of visfatin in different groups of mouse ilum tissues注：A：內(nèi)脂素位置分布，B：內(nèi)脂素 mRNA 水平和積分光密度（IOD 值）紅色箭頭所指為內(nèi)脂素陽(yáng)性信號(hào)的分布；差異極顯著***P<0.001.Note: A: the distribution of visfatin B: the mRNA level and IOD values of visfatinRed arrow refer to the distribution of visfatin; the difference was highly significant, ***P<0.001.內(nèi)脂素對(duì) LPS 誘導(dǎo)的小鼠腸黏膜屏障的影響1 不同試驗(yàn)組腸黏膜屏障相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化緊密連接蛋白 ZO-1，Claudin-1 和分泌型免疫球蛋白 A（sIgA）等是腸道要組分，能夠阻止毒性大分子及微生物入侵，增強(qiáng)腸黏膜的屏障功能。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組中 ZO-1 表達(dá)量較多，主要分布在腸絨毛上皮細(xì)

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本文編號(hào)：2755556