【摘要】：隨著畜牧業(yè)的發(fā)展水平和人類生活水平的提高,消費者越來越重視牛肉和牛乳品質(zhì)。牛肉品質(zhì)和乳品質(zhì)性狀都是復雜經(jīng)濟性狀,多基因共同調(diào)控其表型變化。隨著后基因組學時代的到來,篩查與挖掘肉牛肉質(zhì)性狀和奶牛乳脂性狀相關(guān)且具有重大遺傳效應(yīng)的候選功能基因,成為當前科研工作者主要挑戰(zhàn)�；谡n題組前期組學分析結(jié)果,ACADSB、CD44等基因可能對牛脂肪代謝具有重要的調(diào)控作用。本研究以ACADSB、CD44為候選基因,從分子水平出發(fā),解析其與脂肪代謝的相關(guān)關(guān)系。以牛胎兒成纖維細胞、乳腺上皮細胞為研究對象,檢測目的基因在mRNA和蛋白水平的表達情況,對細胞內(nèi)甘油三酯、膽固醇和脂肪酸含量進行測定,同時利用PCR array技術(shù),在細胞水平上驗證ACADSB和CD44基因?qū)εＶ敬x的影響。結(jié)果顯示:ACADSB和CD44基因能夠調(diào)控細胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇含量,并通過調(diào)控脂肪酸代謝通路的相關(guān)基因調(diào)節(jié)細胞內(nèi)相關(guān)脂肪酸的含量。細胞內(nèi)脂肪酸含量檢測結(jié)果顯示:在乳腺上皮細胞系中,ACADSB基因正向調(diào)控丁酸、己酸、十七烷酸、反式亞油酸的含量(P0.05);CD44基因負向調(diào)控硬脂酸含量,正向調(diào)控亞麻酸、順式-8,11,14-二十碳三烯酸的含量。但在胎兒成纖維細胞中,ACADSB基因負向調(diào)控細胞內(nèi)丁酸的含量(P0.05),正向調(diào)節(jié)細胞內(nèi)十五烷酸和順式-11,14-二十碳二烯酸的含量(P0.05);CD44正向調(diào)控二十二烷酸、棕櫚酸和反式油酸的含量(P0.05),而負向調(diào)控細胞內(nèi)十三烷酸、硬脂酸和順式-5,8,11,14-二十碳四烯酸的含量(P0.05)。PCR array結(jié)果發(fā)現(xiàn):CD44沉默調(diào)控ACADSB基因表達水平下調(diào)。利用CRISPR-Cas9技術(shù),構(gòu)建ACADSB和CD44基因敲除細胞系,并進行轉(zhuǎn)錄組測序,進一步驗證候選基因功能并解析與脂肪代謝的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果顯示:候選基因敲除細胞系在mRNA和蛋白水平上的表達均顯著降低,對細胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇的調(diào)控也與前期結(jié)果一致。轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn):部分脂肪酸代謝通路相關(guān)基因的表達水平也與PCR array結(jié)果相一致,進一步驗證了ACADSB和CD44基因通過調(diào)控相關(guān)基因的表達,參與脂肪代謝進程。ACADSB基因敲除細胞系中差異基因蛋白互作關(guān)系預(yù)測分析發(fā)現(xiàn):CD44基因被上調(diào)基因COL5A3和COL6A2以下調(diào)基因COL1A2、LAMC2、FN1和COL3A1共同激活,導致CD44表達下調(diào)。提示ACADSB基因的沉默,也導致CD44的表達水平下調(diào)。利用基因編輯技術(shù),建立敲除小鼠模型,在動物活體水平上驗證基因表達調(diào)控作用。結(jié)果表明:ACADSB基因和CD44基因敲除小鼠的生長、發(fā)育和繁殖正常。血清學檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):ACADSB和CD44基因基因敲除小鼠血清中甘油三酯的含量顯著低于對照組(P0.05)。ACADSB基因敲除小鼠在乳腺和肌肉組織中甘油三酯的含量均降低,而膽固醇的含量并無明顯變化;ACADSB基因敲除小鼠的脂肪組織中甘油三酯和膽固醇的含量均顯著降低(P0.05)。CD44基因敲除小鼠的乳腺和肌肉組織中甘油三酯的含量降低,但在脂肪組織中,表現(xiàn)出明顯的性別差異,在雌性小鼠的脂肪組織中甘油三酯的含量顯著降低(P0.05),而在雄性小鼠的脂肪組織中,其甘油三酯含量顯著升高(P0.05),具體的作用機制仍需進一步探討。小鼠甘油三酯酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示:與對照組相比,ACADSB基因敲除的純合型小鼠乳汁中甘油三酯含量降低(P0.05),而CD44基因敲除的純合型小鼠乳汁中甘油三酯含量顯著降低(P0.05)。ACADSB基因敲除小鼠組織中脂肪酸含量及成分的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):在雄鼠的脂肪組織中,共檢測到7種脂肪酸,純合型與野生對照組相比,肉豆蔻酸、棕櫚油酸、反式亞油酸、亞油酸、二十烷酸、亞麻酸、順式-5,8,11,14-二十碳四烯酸的含量都增加,其中棕櫚油酸、亞油酸、二十烷酸的含量均顯著增加(P0.05),其脂肪酸含量的改變主要受到FABP3、FABP5和ACSL1等基因表達水平的調(diào)控。而CD44基因敲除小鼠組織中脂肪酸含量及成分的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):在雄鼠的肌肉組織中,共檢測到6種脂肪酸,純合型與野生對照組相比,十三烷酸、油酸、亞油酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸的含量均降低,并且棕櫚酸的含量顯著低于對照組(P0.05),這些脂肪酸的改變主要是受ACOX2、FABP5、ACAD11等基因表達水平的調(diào)控。而在雌鼠的乳腺組織中,共檢測到5種脂肪酸,純合型與對照組相比,十一酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸含量均降低,其中棕櫚酸的含量顯著減少(P0.05),其脂肪酸含量的變化,主要受FABP2、FABP1、ACSL5等基因表達水平的調(diào)控。為了探討ACADSB和CD44及PRSS2基因是否具有可用于未來牛肉質(zhì)和乳品質(zhì)性狀標記輔助選擇的分子標記,本研究以中國西門塔爾牛和中國荷斯坦奶牛群體為研究對象,采用直接測序的方法進行候選基因遺傳多態(tài)性的分析。多態(tài)性分析結(jié)果顯示:ACADSB基因I8-54GA和I8-114GA位點與產(chǎn)奶量顯著相關(guān);E8-71CA、I8-106CG、I8-114GA和I8-54GA位點與乳糖含量顯著相關(guān);I7-3669G/T、I7-3974G/A、I8-118GA和I8-119GA位點與腰部肉厚和眼肌面積等肉質(zhì)和胴體性狀顯著相關(guān);I8-374CT位點與大腿肉厚、眼肌面積等肉質(zhì)和胴體性狀顯著相關(guān)。CD44基因I11-1597GC位點與乳品質(zhì)性狀中的乳糖含量、乳蛋白率和干物質(zhì)量顯著相關(guān)。I12-112TC位點與產(chǎn)奶量、乳蛋白率、乳糖、校正奶量和乳脂率等乳品質(zhì)性狀顯著相關(guān)。I11-1597GC位點與胴體重、屠宰率和腎臟脂肪量顯著相關(guān);I12-37CA位點與屠宰率和屠宰酸度顯著相關(guān);I12-112TC位點與屠宰率、背膘厚以及排酸后酸度顯著相關(guān);I16-8383 AG位點與屠宰率和眼肌面積顯著相關(guān)。PRSS2基因I3-265GA、E4-31AT、E4-68GA、E4-78GC和I4-160TC位點與乳蛋白含量顯著相關(guān)。I1-611CG、I1-668GA、I1-710GA和I1-819AG位點與眼肌面積的顯著相關(guān)。ACADSB、CD44及PRSS2基因多態(tài)性位點均與牛肉質(zhì)和乳品質(zhì)性狀相關(guān),可以作為遺傳標記應(yīng)用到牛的遺傳育種的過程。本研究在前期轉(zhuǎn)錄組學分析的基礎(chǔ)上,以ACADSB和CD44為候選基因,在細胞水平上驗證候選基因?qū)毎麅?nèi)甘油三酯、膽固醇、脂肪酸含量的影響,以及對相關(guān)基因的調(diào)控作用;并構(gòu)建了敲除小鼠模型,在動物水平驗證敲除基因?qū)∪�、乳腺及脂肪組織中甘油三酯、膽固醇和脂肪酸含量的影響,探討了ACADSB和CD44等基因的SNPs位點作為遺傳標記應(yīng)用于牛的分子育種。本研究為奶牛、肉牛脂肪性狀的選擇和新品種的培育提供基因資源和理論基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S823.2

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本文編號：2755460