【摘要】：體細胞核移植(SCNT)技術(shù)可使高度分化的體細胞通過重編程獲得全能性,從而發(fā)育成新的動物個體。該技術(shù)在治療性克隆生產(chǎn)、疾病模型建立、再生醫(yī)藥制造、家畜性狀改良、瀕危物種保護等方面的應(yīng)用潛力巨大。但長期以來,利用SCNT技術(shù)生產(chǎn)克隆動物的效率極低,主要表現(xiàn)在胚胎早期發(fā)育的高損率、克隆動物在孕期或圍產(chǎn)期死亡、克隆動物出生后的發(fā)育異常等方面,這嚴重阻礙著該技術(shù)的推廣應(yīng)用。當(dāng)前廣泛認為,供體細胞基因組上的表觀遺傳修飾未能被卵胞質(zhì)充分地重編程是導(dǎo)致克隆效率低下的主要原因。研究表明,牛SCNT胚胎在合子基因組激活(ZGA)時期存在異常高水平的組蛋白H3第九位賴氨酸殘基三甲基化(H3K9me3)和二甲基化(H3K9me2)修飾,猜測這兩種表觀標(biāo)記是導(dǎo)致牛SCNT重編程不充分的障礙之一。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)和實時熒光定量PCR(qPCR)實驗,首次確認了造成上述異常修飾的兩個組蛋白H3K9去甲基化酶——KDM4D和KDM4E。通過胚胎顯微注射技術(shù),在牛體外受精(IVF)胚胎中干擾KDM4D和KDM4E基因表達,而在SCNT胚胎中過表達KDM4D和KDM4E,以此研究這兩個因子在受精胚胎正常發(fā)育和SCNT胚胎重編程過程中的作用。主要的實驗內(nèi)容和結(jié)果如下:1.通過RNA-seq數(shù)據(jù)和qPCR實驗,確定了牛IVF與SCNT胚胎中KDM4D和KDM4E基因表達量的變化模式。結(jié)果顯示這兩個基因在兩類胚胎中均呈現(xiàn)ZGA時期一過性高表達的轉(zhuǎn)錄情況,并且KDM4E的表達量高于KDM4D,而SCNT胚胎中這兩個基因的表達量均顯著低于同時期的IVF胚胎。2.通過干擾片段的顯微注射實驗,研究沉默KDM4D和KDM4E基因的表達對IVF胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同時干擾這兩個基因會顯著抑制IVF胚胎ZGA階段H3K9甲基化的抹除,影響衛(wèi)星序列satellite I和部分合子基因的轉(zhuǎn)錄激活,并損害了胚胎的體外發(fā)育能力,表現(xiàn)在囊胚發(fā)育率低下、囊胚細胞數(shù)下降和囊胚凋亡水平上升等方面。而單獨沉默KDM4D或KDM4E的差異結(jié)果表明,KDM4E對牛受精胚胎的發(fā)育發(fā)揮著更重要的作用。3.通過KDM4D和KDM4E mRNA的顯微注射實驗,研究過表達野生型和功能缺失突變型KDM4D或KDM4E對SCNT胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達野生型的KDM4D或KDM4E均會高效去除SCNT胚胎ZGA階段的H3K9甲基化標(biāo)記,恢復(fù)衛(wèi)星序列satellite I和部分合子基因的轉(zhuǎn)錄激活,并改進胚胎體外和體內(nèi)的發(fā)育能力,表現(xiàn)在囊胚發(fā)育率提高、囊胚內(nèi)細胞團細胞數(shù)增多和促進克隆牛出生等方面,但過表達突變型的KDM4D或KDM4E并不會改善SCNT胚胎的發(fā)育。4.通過RNA-seq數(shù)據(jù),確定8細胞期牛IVF和SCNT胚胎的差異表達基因(DEGs),以及在SCNT胚胎中過表達KDM4E對這些DEGs的調(diào)整情況。結(jié)果在6,948個上述DEGs中,有1,893個SCNT胚胎低表達的基因可被過表達的KDM4E再次激活,這類DEGs主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胚胎發(fā)育、細胞周期和基因表達調(diào)控等生物過程,以及緊密連接、干性因子、蛋白泛素化和Hippo信號等細胞通路。同時,過表達KDM4E使2,057個SCNT胚胎高表達基因的轉(zhuǎn)錄水平得到調(diào)整。這類DEGs主要參與氧化還原穩(wěn)態(tài)、蛋白甲基化修飾和DNA損傷應(yīng)答等生物過程,以及氧化磷酸化、蛋白及RNA降解和RNA轉(zhuǎn)錄等細胞通路。綜上所述,本研究一方面證明了牛IVF胚胎ZGA時期H3K9me3和H3K9me2修飾的抹除由同時期高表達的KDM4D和KDM4E調(diào)控,干擾這兩個因子的表達不利于IVF胚胎的發(fā)育。另一方面證實了牛SCNT胚胎ZGA時期異常高的H3K9me3和H3K9me2修飾與其內(nèi)源低表達的KDM4D和KDM4E有關(guān),過表達這兩個因子促進了SCNT介導(dǎo)的體細胞重編程,并提高了克隆牛的生產(chǎn)效率。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823
【圖文】：

圖 1 1 多種模式動物的合子基因組激活時期(Tadros et al. 2009)Fig. 1 1 Timing of zygotic genome activation in several model organisms椎動物中，按細胞周期來說，小鼠胚胎具有最早的 ZGA 起始時期 2 細胞期（第 2 d，第 1 細胞周期）激活～800 個基因和～3,500 個 和主波 ZGA(Hamatani et al. 2004; Xue et al. 2013)。相比之下，其波 ZGA 的啟動更滯后。人胚胎的次波 ZGA 發(fā)生在 2 4 細胞期（第 ），激活～1,000 個基因，主波 ZGA 發(fā)生在 4 8 細胞期（第 3 d，第～2,500 個基因(Yan et al. 2013)。大鼠(Whitworth et al. 2004)、猴子2

下內(nèi)容根據(jù)已有的研究情況，對這些調(diào)控機制進行歸納和闡述�；蚪M激活的機制 的啟動有四種常見模型，一是核質(zhì)比模型（圖 1 2A），主要認為早期核相對胞質(zhì)的體積占比增高，同時胞質(zhì)中的 ZGA 抑制因子（紅色），低于一定閾值便會啟動合子基因轉(zhuǎn)錄(Newport et al. 1982a; New二是母源鐘模型（圖 1 2B），主要認為 ZGA 的啟動時間由不依賴于子（綠色）決定，這些因子達到一定數(shù)量或活性便會啟動合子基因轉(zhuǎn)錄)。三是遺傳物質(zhì)模型（圖 1 2C），主要認為具有充足激活因子（藍色NA 模板達到一定數(shù)量和表觀開放程度才能開啟合子基因的表達(Li e al. 2014b)。四是細胞周期模型（圖 1 2D），是早期卵裂迅速的物種特要認為早期卵裂的短細胞周期不利于合子基因轉(zhuǎn)錄，細胞周期延長后llart et al. 2013; De Renzis et al. 2007)。下文將從以下四個方面揭示胚機制：（1）細胞周期和核質(zhì)比調(diào)控；（2）染色體結(jié)構(gòu)調(diào)整；（3）轉(zhuǎn)錄子；（4）與母源物質(zhì)清除的關(guān)系。

1 4 通過 RNA-seq 確定牛胚胎中合子基因的不同策略(Graf et al. 2C）（E）胚胎發(fā)育各時期三個基因的測序讀值在參考基因組的分（B）（D）（F）胚胎發(fā)育各時期三個基因的測序表達量。rent strategies for fine mapping of genome activation in bovine embryds distribution on the reference genome of three genes at the different ) (D) (F) Expression levels of three genes at the different embryonic st為詳實地總結(jié)了不同物種 ZGA 的發(fā)生時間、參與機制一進程對其他延伸學(xué)科的發(fā)展意義巨大，包括表觀遺傳、體細胞誘導(dǎo) iPSCs 和體細胞克隆重編程等等。盡管動和 ZGA 啟動是相對保守的，但不同物種之間的具體情況控現(xiàn)象的相互反饋機制還知之甚少，期待未來不久會有

本文編號：2755041