發(fā)布時(shí)間：2020-07-14 09:19

【摘要】：氣候變化是全世界生態(tài)系統(tǒng)和畜牧業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)生存的主要威脅之一,而熱中性區(qū)被認(rèn)為是反芻動(dòng)物將新陳代謝和生理調(diào)節(jié)至正常水平的適當(dāng)溫度范圍。溫度和濕度過高都將引起動(dòng)物的細(xì)胞和線粒體氧化損傷,溫濕度指數(shù)(Temperature and Humidity Index,THI)是反映牲畜熱應(yīng)激強(qiáng)度的主要指標(biāo)。近年來,大多數(shù)關(guān)于熱應(yīng)激的研究都集中在單胃動(dòng)物和奶牛身上,而波爾山羊作為一種理想的肉用山羊品種,其生產(chǎn)性能與繁殖性能的發(fā)揮與所處環(huán)境溫濕度直接相關(guān),因此研究熱應(yīng)激對(duì)其的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。瘤胃是反芻動(dòng)物獨(dú)有的器官,其中含有大量的微生物,在維持宿主正常消化和吸收方面發(fā)揮重要作用。高通量測(cè)序是近年新興的檢測(cè)技術(shù),深度測(cè)序可以通過有效的空間和時(shí)間視圖獲得微生物群落的生物信息,且PICRUSt可以僅基于16S擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù),而不需要全部的基因組來預(yù)測(cè)微生物功能。因此,本研究旨在利用16S擴(kuò)增子測(cè)序等技術(shù)檢測(cè)熱應(yīng)激對(duì)山羊瘤胃pH、揮發(fā)性脂肪酸(Volatile Fatty Acid,VFA)和微生物組的不利影響。本研究選擇健康狀況良好的8只雌性山羊(波爾×關(guān)中奶山羊,18月齡,32.8±3.4kg),隨機(jī)分為2組,分配至2個(gè)代謝倉(cāng)A和B(代謝倉(cāng)位于陜西楊凌的西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)站,室內(nèi)溫度和濕度可精確控制,精確度偏差為±0.5°C和±5%,4只山羊/倉(cāng))。以23°C,50%為初始溫濕度(預(yù)飼30天),在第30天時(shí)將A倉(cāng)設(shè)為對(duì)照組(CK),之后設(shè)定4組溫度(26°C,30°C,34°C,38°C)和4組相對(duì)濕度(35%,50%,65%,80%),采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)計(jì)算出16個(gè)溫濕度指數(shù)(THIs),每個(gè)處理進(jìn)行5天,各處理之間無時(shí)間間隔。通過口腔插管收集瘤胃液樣品,測(cè)定pH后分離5 mL樣品儲(chǔ)存于-20°C以備后續(xù)VFA檢測(cè),其余樣品提取DNA后,部分采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR)檢測(cè)瘤胃微生物含量,部分在16個(gè)逐漸增加的溫濕度指數(shù)(TH1~TH16)下利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)瘤胃細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明:(1)熱應(yīng)激顯著提高了pH、乙酸比例、乙丙比(P0.05),降低了總揮發(fā)性脂肪酸含量與丁酸、戊酸比例(P0.05),但對(duì)丙酸、異丁酸、異戊酸比例影響不顯著。(2)通過qPCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激顯著改變了原蟲、產(chǎn)甲烷菌、Fibrobacter succinogenes和Ruminococcus flavefaciens的數(shù)量,但對(duì)總細(xì)菌含量無顯著影響。(3)外界溫濕環(huán)境變化對(duì)山羊瘤胃菌群α多樣性(Ace、Chao 1、Shannon、Simpson等)沒有顯著影響,但顯著改變了山羊瘤胃微生物群的主要門和屬結(jié)構(gòu)。隨著THI增大,Firmicutes豐度降低(從67.09%至27.21%),Bacteroidetes豐度增加(從19.41%至65.55%),兩個(gè)門之間呈負(fù)相關(guān)。在屬水平上,Prevotella_1豐度均最豐富,且高TH組含量更多。隨著THI的增加,部分益生菌含量下降,致病菌豐度增加。同時(shí),TH組與CK組之間聚類不同,高TH組與低TH組分別聚類,且從TH7到TH9時(shí)(THI從80.61到82.92)瘤胃細(xì)菌群落改變明顯。(4)利用PICRUSt來預(yù)測(cè)細(xì)菌功能,預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,隨THI升高,碳水化合物和能量代謝顯著改變(P0.05)。通過對(duì)菌門與代謝途徑進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),菌群中Firmicutes豐度與氨基糖和核苷酸糖代謝呈負(fù)相關(guān)(r=-0.432,P0.01)。Bacteroidetes豐度與嘌呤代謝呈正相關(guān)(r=0.412,P0.01),但與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(r=-0.455,P0.01)和氨酰-tRNA生物合成呈負(fù)相關(guān)(r=-0.417,P0.01)。綜上所述,環(huán)境THI的改變能顯著影響山羊pH、VFA和瘤胃微生物的種類和多樣性,不同指標(biāo)之間也存在一定的關(guān)聯(lián)。THI增大時(shí)會(huì)增加山羊瘤胃的致病菌而減少益生菌,且當(dāng)THI從80.61增大到82.92時(shí)細(xì)菌組成變化大。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S827
【圖文】：

圖 3-1 不同 THI 樣本基于操作分類單元（OTU）（3%差異）的稀釋性曲線Rarefaction analyses based on the operational taxonomic units (OTUs) (3% divedifferent THI samples.表 3-2 不同處理比對(duì)至 16S rRNA 基因數(shù)據(jù)庫(kù)后的 OTU 的數(shù)量與樣本多樣umber of OTUs, estimated sample diversity aligning the 16S rRNAgene databatreatments.ACE Chao 1 Shannon Simpson OTU 687.88±142.36 707.83±147.81 3.65±0.66 0.09±0.07 517.33±103.27775.70±55.27 784.14±42.48 3.91±0.50 0.06±0.03 527.67±78.62 738.55±75.15 749.12±70.14 3.40±0.64 0.14±0.12 515.33±40.08 691.60±106.81 701.11±90.36 3.44±0.78 0.10±0.08 504.00±96.97 804.88±108.26 811.95±113.39 4.04±0.33 0.05±0.02 595.00±79.05 715.51±149.28 708.60±138.67 3.86±0.55 0.07±0.04 534.00±100.37811.46±138.59 815.53±133.17 4.41±0.18 0.03±0.01 622.00±93.26 696.89±130.69 707.80±151.18 4.14±0.19 0.04±0.01 540.33±87.23 790.86±86.19 792.52±83.22 4.43±0.09 0.03±0.00 599.00±16.37

26圖 3-2 a.門水平上的瘤胃細(xì)菌群落。面積堆積圖顯示了 THI 組中相對(duì)細(xì)菌在門水平的分布。b.不同 THI 組間最主要的屬（相對(duì)豐度小于 2％的進(jìn)行合并）。c. 熱圖表示不同 THI 組間與熱應(yīng)激相關(guān)的前 50 個(gè)屬的相對(duì)百分比;基于 Minkowski 距離沿 X 軸的 THI 組和沿 Y 軸的細(xì)菌屬進(jìn)行分層聚類。不同顏色代表每個(gè) THI 組中屬的相對(duì)豐度。顏色強(qiáng)度越強(qiáng)，屬的相對(duì)值越大，藍(lán)色表示沒有代表性細(xì)菌。Figure. 3-2 a. Rumen bacterial communities at the phylum level.An acreage plot shows the distributions of the relative bacterial phyla across the THI groups. b.Distribution of the most dominant genera across different THI groups (those with a relative abundance of less than 2% were combined). c. The heatmap representsthe relative percentage of the top 50 genera associated with heat stress across different THI groups; Hierarchical clustering was based on the Minkowski distance ofthe THI groups along the X-axis and the bacterial genera along the Y-axis, respectively. Color represented the relative abundance of genera in each THI group. Thestronger the color intensity, the greater the relative value of genus, and blue indicates that there are no representative bacteria.

高 THI 組聚為另一部分。使用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）能有效地區(qū)分 THI 組之間的觀察結(jié)果（圖3-4c）。結(jié)果表明，不同分組下組內(nèi)樣本個(gè)體聚集在一起而組間差異不大，特別是在 THI較低時(shí)。然而，高 THI 組和低 THI 組之間存在較大的差異，并且隨著 THI 的增加，差異越大。此外，相同溫度或相同濕度下組內(nèi)也存在明顯的聚類，而組間具有很大區(qū)分（圖 3-4d,f）。在只考慮溫度或濕度的影響時(shí)，結(jié)果表明了與低溫（26°C 和 30°C）相比，在高溫（34°C 和 38°C）下，濕度對(duì)瘤胃細(xì)菌組成的影響發(fā)揮著更大的作用。然而，在高濕度和低濕度環(huán)境下，溫度對(duì)瘤胃微生物組的影響較為一致（圖 3-5a-h）。3.2.5 預(yù)測(cè)瘤胃細(xì)菌功能與分子途徑通過對(duì)相關(guān) OTU 使用 PICRUSt 分析

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