【摘要】：結(jié)核病(tuberculosis,TB)是一種慢性消耗性的人獸共患傳染病,由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis Complex,MTBC)所引起。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì),2016年的全球結(jié)核病的發(fā)病例約為1040萬,死亡約130萬例。結(jié)核病已經(jīng)成為了單一病原菌致死疾病的首位。近來,WHO制定了“消滅結(jié)核病策略”,最終目標(biāo)在2035年消滅結(jié)核病。眾所周知,早期的診斷和適當(dāng)治療可以預(yù)防大多數(shù)人死于結(jié)核病。因此,亟待需要開發(fā)一種高效的結(jié)核病診斷方法。基于血清學(xué)診斷技術(shù)而建立起來的間接ELISA檢測(cè)、操作簡單迅速,且以WHO倡導(dǎo)的無痰樣本為檢測(cè)對(duì)象,是結(jié)核病診斷技術(shù)的研發(fā)熱點(diǎn)。然而,目前并沒有較為理想的商品化ELISA診斷試劑盒,特別是針對(duì)肺外結(jié)核(EPTB)及早期痰涂片陰性肺結(jié)核(PTB-SN)的診斷。因此,開發(fā)新的診斷方法潛在策略之一就是篩選新的抗原候選物。本實(shí)驗(yàn)從牛分枝桿菌(M.bovis)、卡介苗相對(duì)結(jié)核分枝桿菌(M.tb)基因組的差異區(qū)域入手,對(duì)差異區(qū)(RD)的129個(gè)開放閱讀框(ORFs)分別進(jìn)行克隆和原核表達(dá)與純化,利用臨床肺結(jié)核(PTB)及肺外結(jié)核(EPTB)樣本對(duì)RD蛋白進(jìn)行篩選,以期篩選出針對(duì)不同類型結(jié)核病的新型診斷標(biāo)識(shí);同時(shí),構(gòu)建BCG突變體庫,從突變庫中篩選生物膜成膜能力加強(qiáng)的突變體。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)RD區(qū)基因的克隆、表達(dá)與純化對(duì)RD區(qū)的129個(gè)基因分別進(jìn)行克隆,選擇p ET-32a作為融合載體,經(jīng)過酶切、連接和測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建了78個(gè)重組質(zhì)粒,涉及到除RD12區(qū)域外的其他15個(gè)RD區(qū)的基因。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo),獲得68個(gè)表達(dá)的蛋白。根據(jù)功能注釋,數(shù)量較多的前5類蛋白為:假想蛋白、噬菌體蛋白、膜/跨膜蛋白、分泌型蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。最后對(duì)蛋白進(jìn)行純化,其中有7個(gè)蛋白是可溶性表達(dá),它們分別為Rv0222、Rv0311、Rv1766、Rv1767、Rv1976c、Rv2660c和Rv3120;其他均為非可溶性表達(dá)。(2)RD蛋白的初步篩選臨床PTB、EPTB標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的確定:從武漢市醫(yī)療救治中心收集有明顯臨床癥狀并確診的肺結(jié)核及肺外結(jié)核病人血清,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室建立的人IFN-γ體外2018釋放法(IGRA)及TB-DOT商品化試劑盒對(duì)臨床結(jié)核病人血清做進(jìn)一步檢測(cè),選擇6份雙陽性血清,每3份進(jìn)行等量混合作為標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的確定:來自本校的志愿者樣本,經(jīng)過PPD皮試、IGRA法及TB-DOT商品化試劑盒檢測(cè),選擇6份3種方法檢測(cè)均陰性的血清,每3份進(jìn)行等量混合作為標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。以O(shè)D630陽性血清/OD630陰性血清(P/N)≥2作為初篩標(biāo)準(zhǔn),用i ELISA方法對(duì)68個(gè)蛋白分別進(jìn)行篩選,得到29個(gè)蛋白與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清有特異性識(shí)別反應(yīng)。其中肺結(jié)核組陽性血清篩選到19個(gè)抗原,包括Rv3872、Rv3874、Rv3875及Rv1981c等,所在區(qū)域分布在RD1-RD4、RD6、RD8、RD10-RD11、RD13、RD15-RD16;肺外結(jié)核陽性血清篩選到14個(gè)抗原,如Rv3872、Rv1577c、Rv1508c及Rv1514c等,所在區(qū)域分布在RD1-RD4、RD6、RD8、RD10、RD13-RD14、RD16。而Rv3872(RD1)、Rv0222(RD4)、Rv0309(RD8)和Rv3403c(RD16)四種抗原被以上2種結(jié)核病陽性血清共同篩選到。(3)潛在標(biāo)識(shí)抗原的復(fù)篩經(jīng)過受試者工作曲線(ROC)分析,在PTB組,Rv0222與Rv3403c顯示出最高的曲線下面積(AUC)值,分別為0.8247(95%CI,0.7496-0.8997)和0.8223(95%CI,0.7431-0.9015),對(duì)應(yīng)ESAT6/CFP10的AUC值為0.7468(95%CI,0.6576-0.8360)。即Rv0222和Rv3403c在肺結(jié)核涂片陽性組(PTB-SP)中表現(xiàn)出最高的診斷能力(83.3%/80%,79.1%/80%),而Rv3403c在PTB-SN中表現(xiàn)出最高的診斷能力(敏感性:70%,特異性:80%)。在EPTB組,Rv0222展示出最高的診斷價(jià)值(AUC:0.7706,敏感性:70%,特異性:82.5%),對(duì)應(yīng)ESAT6/CFP10的AUC值為0.7394(95%CI,0.6092-0.8695),敏感性為60%,特異性為70%。且聯(lián)合Rv0222與Rv3403c蛋白能提高PTB-SN患者的檢出率,對(duì)應(yīng)的敏感性特異性分別為86.6%和72.5%。(4)Rv0222與Rv3403c蛋白的免疫學(xué)評(píng)估Rv0222與Rv3403c蛋白免疫小鼠后,小鼠血清中抗Rv0222的抗體總Ig G效價(jià)為2~(11)×100,同時(shí)也測(cè)得Ig G1與Ig G2a亞型的效價(jià)為2~(12)×100與2~(10)×100;檢測(cè)抗Rv3403c總抗體Ig G效價(jià)為2~(12)×100,Ig G1與Ig G2a亞型的效價(jià)同樣為2~(12)×100與2~(10)×100。PBS免疫組并未檢測(cè)到抗體滴度。分離的脾淋巴細(xì)胞經(jīng)Rv0222和Rv3403c刺激后,蛋白免疫組與PBS免疫組的刺激指數(shù)有差異(p0.05)。且蛋白免疫組的細(xì)胞上清中IFN-γ與TNF-α的濃度高于PBS免疫組,差異極顯著(p0.01和p0.001)。(5)卡介苗生物膜相關(guān)突變體庫的構(gòu)建用Myco Mar T7轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)獲得了3170株卡介苗突變體文庫,隨機(jī)挑取1000株突變體進(jìn)行PCR鑒定,有960株擴(kuò)增出目的條帶,預(yù)估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高達(dá)96%。進(jìn)而對(duì)鑒定成功的突變體轉(zhuǎn)接到Sauton液體培養(yǎng)基進(jìn)行成膜能力的初步篩選,其中148株突變體成膜能力較BCG增強(qiáng)。綜上所述,來自RD4區(qū)的Rv0222和RD16區(qū)的Rv3403c均具有潛在的結(jié)核病抗體診斷能力,特別在難以診斷的肺外結(jié)核、早期的涂陰肺結(jié)核的檢測(cè)靈敏度高于其他候選抗原。且這2個(gè)抗原免疫小鼠后,均能誘導(dǎo)高滴度的總Ig G、Ig G1與Ig G2a抗體產(chǎn)生和高濃度IFN-γ和TNF-α的分泌,表明這兩個(gè)蛋白在小鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答。其中,未知功能蛋白R(shí)v3403c的相關(guān)結(jié)果為首次報(bào)道。此外,構(gòu)建了卡介苗生物膜相關(guān)的突變體文庫,為后期研究分枝桿菌生物膜與疫苗的相關(guān)性提供了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61
【圖文】：

結(jié)核分枝桿菌 RD 區(qū)診斷標(biāo)識(shí)抗原的篩選及卡介苗生物膜相關(guān)突變體庫的構(gòu)建森（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法對(duì)菌體進(jìn)行染色，鏡下觀察，分枝桿菌染成紅色，而其他細(xì)菌及背景物質(zhì)染成藍(lán)色。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核桿菌細(xì)胞壁外有一層莢膜的存在，主要成分是多糖與分泌蛋白，這種結(jié)構(gòu)的形成對(duì)菌體有一定的保護(hù)性，也進(jìn)一步導(dǎo)致結(jié)核桿菌對(duì)外在理化因素有較強(qiáng)的抵抗力。60 下 30 分鐘便可將 M.tb 殺滅；75%的酒精和紫外線也可將其殺滅(Daffe and Etienne 1999; Stokes et al2004)。

圖 1-2 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv 和牛源臨床株 M. tb 1458 基因組圖譜Fig.1-2 The whole genomes of M. tb H37Rv and M. tb 14581.2.2 牛分枝桿菌美國學(xué)者 Smith 于 1889 年首次從細(xì)菌形態(tài)學(xué)，培養(yǎng)特征和病理學(xué)等方面對(duì)牛結(jié)核病進(jìn)行了描述；1911 年英國皇家學(xué)會(huì)稱牛源株為牛分枝桿菌（Mcobacteriumbovis, M. bovis），但該名直到 1970 年才通過正式發(fā)表而認(rèn)可(郭愛珍 2015)。M.bovis 是導(dǎo)致牛結(jié)核病的主要的病原菌，其感染譜較為廣泛，除了感染人與牛外，還可以導(dǎo)致羊、馬、狗、貓、鹿、狐、美洲野牛、水牛、野兔等感染結(jié)核病。牛分枝桿菌 AF2122/97 株于 1997 年被首次分離，來自于一頭肺部、支氣管淋巴結(jié)發(fā)生較為嚴(yán)重干酪樣病變的病牛組織中。在 2003 年完成了對(duì)牛分枝桿菌AF2122/97 株的全基因組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其基因組大小有 4345492bp，G+C含量為 65.63%，含有 3952 個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因，一個(gè)噬菌體和 42 個(gè)插入元件。

結(jié)核分枝桿菌 RD 區(qū)診斷標(biāo)識(shí)抗原的篩選及卡介苗生物膜相關(guān)突變體庫的構(gòu)建齒類動(dòng)物間的流行率為 9-31％，亦可感染人，牛，羊，野生動(dòng)物等。對(duì)田鼠分枝桿菌感染人的病例，最初在免疫力功能受損的人身上分離到，但近些年有報(bào)道稱，在免疫力正常的結(jié)核病患者身上也有分離到此菌 (Frank et al 2009)。在基因組方面，M.microti 相對(duì)于結(jié)核分枝桿菌，缺失了 RD7、RD8、RD9 和 RD10 區(qū)域。羊分枝桿菌（Mycobacterium caprae）首次從一只患有結(jié)核病的山羊身上分離得到的，也可感染牛，野豬等。人類結(jié)核病的患者中也有羊分枝桿菌分離的報(bào)道。在基因組方面，其相對(duì)于結(jié)核分枝桿菌，缺失區(qū)域有 RD5、RD6、RD7、RD8、RD9、RD10、RD12 和 RD13 (Aranaz et al 2003)�？傊�，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTBC）是一組高度保守、相關(guān)連的分枝桿菌群，由共同的起始菌進(jìn)化而來，根據(jù)各自的宿主偏向性和生物特性進(jìn)行分類，其進(jìn)化歷程見圖 1-3。

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本文編號(hào)：2754583