【摘要】：偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)作為困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病病原之一。20世紀80年代開始,PRV相繼地在全國各地爆發(fā),且根據(jù)測序結(jié)果來看,我國流行的毒株與歐美等國家爆發(fā)流行的毒株不同,處于另外一個進化分支。豬一旦感染PRV后,便很難將其從體內(nèi)清除,造成種豬的終身帶毒,仔豬的倒地死亡,打擊著我國的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展。p53作為動物基因組的“守護者”,扮演著重要角色。p53基因,又稱TP53基因,分子量大小約43.7Ku,受基因磷酸化調(diào)控。p53定位在豬的第12對染色體中,調(diào)控著細胞內(nèi)各種生物信號的傳遞。p53基因擁有抗病毒的功能,病毒侵入機體后都能與p53發(fā)生相互作用。本研究以小鼠作為動物試驗模型,為探索p53在PRV小鼠體內(nèi)復制和致病性的作用,開展了如下試驗:第一部分:PRVgB基因?qū)崟r定量PCR檢測方法的建立首先對本試驗用的PRV病毒(Bartha株)的gB基因設(shè)計熒光定量PCR專用引物,擴增得到目的基因,并對其回收后T-A連接克隆至pMD19T載體,最后成功構(gòu)建并鑒定了重組質(zhì)粒pMD-gB。對構(gòu)建的重組質(zhì)粒倍比稀釋后,利用SYBR Green染料法熒光定量PCR建立了擴增gB基因的標準曲線,曲線方程為:y=-3.8212x + 41.587、R2=0.9997,標曲的線性關(guān)系良好,能作為后續(xù)試驗檢測PRV病毒載量的方法。第二部分:p53影響小鼠體內(nèi)PRV復制及致病力的研究在對小鼠攻毒前,先對所需的PRV病毒材料進行擴增培養(yǎng)和試驗用的p53基因敲除c57BL/6小鼠進行鑒定。然后對野生型(WT)和p53敲除型(p53 KO)小鼠顱內(nèi)注射1.0X 104TCID50滴度的PRV病毒,然后對兩組小鼠做了腦部病毒基因載量和病毒滴度測定試驗,存活率試驗,組織病理切片的H.E染色觀察,炎癥因子的mRNA與抗體水平測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53基因的敲除能夠降低PRV在小鼠體內(nèi)的復制,并減弱其致病性。第三部分:PRV感染小鼠后腦組織的全基因轉(zhuǎn)錄組差異分析對WT小鼠和p53 KO小鼠攻毒后,收獲其腦組織進行小鼠的全基因轉(zhuǎn)錄組差異分析,并對16個差異表達的基因采取定量PCR驗證,確定了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 p53 KO小鼠在PRV攻毒后,干擾素相關(guān)、趨化因子相關(guān)的基因和其他抗病毒相關(guān)基因較WT小鼠都呈顯著性的下調(diào),并通過WT小鼠的接毒對照試驗,說明了 p53 KO小鼠對PRV不易感,進一步驗證了第二部分的結(jié)果。綜上所述,本研究證明了 p53基因的缺失對PRV在小鼠體內(nèi)復制與致病性起抑制作用。
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

１．１．４．邋１邋ＰＲＶ的侵染路徑逡逑ＰＲＶ造成宿主病發(fā)神經(jīng)癥狀后死亡主要是通過兩條途徑侵入宿主動物的中樞神經(jīng)逡逑系統(tǒng)如圖ｌ－２［５ｎ］所示。兩種路徑分別由圖１－２中黑線和紅線表示，二者共同點是都通過逡逑鼻腔為進入口，但隨后前者（黑線）通過鼻腔粘膜進入上頡神經(jīng)后運輸?shù)饺嫔窠?jīng)，再逡逑經(jīng)過腦橋漫延感染整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)；后者（紅線）則是經(jīng)嗅覺神經(jīng)為主干從嗅球、丘逡逑６逡逑

：．：．ｖ；’，．＇栙逡逑２５０ｂｐ邋＾逡逑圖２－１邋ｇＢ基因的ＰＣＲ擴增電泳圖逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋ｇＢ邋ｇｅｎｅ邋ｂｙ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００ＤＮＡ相對標準分子質(zhì)量；１：陰性對照；２－３：擴增ｇＢ基因逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋２－３：邋ｇＢ邋ｇｅｎｅ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑２．邋３．２單克隆菌落ＰＣＲ鑒定逡逑ＰＣＲ反應結(jié)束后，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，說明了這７個菌落均成功轉(zhuǎn)化進了連逡逑接好的重組陽性質(zhì)粒，見圖２－２。逡逑Ｍ１２３４５６邐７８逡逑a懾義稀觶齲殄義賢跡玻插澹紓祿虻模校茫壹ㄍ煎義希疲椋玨澹玻插澹遙澹螅酰歟簦簀澹錚駑澹校茫義澹椋洌澹睿簦椋媯椋悖幔簦椋錚鑠義希停哄澹模蹋玻埃埃埃模危料嘍員曜擠腫又柿�；１－ＡP哄危紓祿潁唬福閡跣遠哉斟義希停哄澹模蹋玻埃埃板澹模危鈴澹停幔潁耄澹潁誨澹保罰哄澹紓洛澹紓澹睿澹誨澹福哄澹危澹紓幔簦椋觶邋澹悖錚睿簦潁

本文編號：2754421