【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)引起的病毒性傳染病。1995年,我國(guó)第一次暴發(fā)PRRS在北京郊區(qū),2006年,由PRRS經(jīng)典毒株突變株引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(High pathogenic porcine reproductive and respiratory disease,HP-PRRS)迅速蔓延全國(guó)。主要臨床表現(xiàn)為育肥豬和仔豬感染后的呼吸道癥狀,妊娠母豬感染后出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和流產(chǎn)后發(fā)情不規(guī)則等,嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的GP4基因進(jìn)行原核表達(dá),構(gòu)建SUMO原核表達(dá)系統(tǒng),誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶性GP4蛋白。根據(jù)GenBank中PRRSV GP4基因設(shè)計(jì)特異性引物,酶切位點(diǎn)為BamHI、XhoI,片段大小約為537bp,從HN07-1株的細(xì)胞毒中提取病毒總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA,將目的基因連接、轉(zhuǎn)化至克隆載體pMD19-T,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-GP4。將測(cè)序正確的GP4基因和表達(dá)載體pET-28a-SUMO連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-SUMO-GP4。把pET-28a-SUMO-GP4重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中,在25℃0.6mmol/L的IPTG條件下,誘導(dǎo)6h,超聲波破碎處理樣品,對(duì)重組蛋白SUMO-GP4進(jìn)行可溶性分析,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析,結(jié)果顯示,重組蛋白SUMO-GP4以可溶性的形式表達(dá),大小約為33kDa。利用Ni-NTA柱純化重組蛋白SUMO-GP4,純化后目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、Western-blot檢測(cè)分析,在33kDa處有目的條帶出現(xiàn),且該重組蛋白能與豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。用SUMO蛋白酶水解純化后的重組蛋白,去掉SUMO蛋白酶標(biāo)簽,獲得目的蛋白GP4,通過(guò)Ni-NTA柱對(duì)目的蛋白GP4進(jìn)行純化,經(jīng)SDS-PAGE電泳、Western Blot檢測(cè)分析,得到一條大小約為19kDa的目的條帶,與預(yù)期結(jié)果相一致,該目的蛋白具有較好的特異性,為PRRSV的檢測(cè)和預(yù)防奠定了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651
【圖文】：

2-12 Protein cleavage reaction system of target pro分（composition） 體積（組蛋白 SUMO-GP4 1000MO Protease Buffer 20.0SUMO 蛋白酶 2.0μddH2O 定容至 1總體積 1000.CR 結(jié)果A 作為 PCR 的模板，對(duì) GP4 全長(zhǎng)目的基性目的條帶被擴(kuò)增出來(lái)，大小約為 537b

圖 2-2 pMD-19-T-GP4 的菌液 PCR 擴(kuò)-2 PCR production of pMD-19-T- GP4 準(zhǔn)；1-2：pMD-19-T-GP4 的 PCR 擴(kuò): pMD-19-T-GP4 gene fragment by PCcontrol 圖 2-1 GP4 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig 2-1 PCR production of GP4 gene-4：GP4 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；5：GP4 陰性4 gene fragment by PCR；5：GP4 Negative組載體雙酶切鑒定結(jié)果P4 經(jīng) BamHI、XhoI 雙酶切后，

2 pMD-19-T-GP4 的菌液 PCR 擴(kuò)增R production of pMD-19-T- GP4 p1-2：pMD-19-T-GP4 的 PCR 擴(kuò)-19-T-GP4 gene fragment by PCRtrol 圖 2-1 GP4 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 2-1 PCR production of GP4 geneP4 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；5：GP4 陰性對(duì)e fragment by PCR；5：GP4 Negative 載體雙酶切鑒定結(jié)果 BamHI、XhoI 雙酶切后，

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本文編號(hào)：2752569