【摘要】：禽滑液囊支原體病是由禽滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae,MS)引起禽類的一種急性或慢性亞臨床型呼吸道感染的疾病,感染可引發(fā)家禽氣囊炎、腱鞘炎,關(guān)節(jié)及足墊腫脹并伴有炎膿性積液,給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前我國還無商品化的MS疫苗上市,本試驗(yàn)旨在開發(fā)出一種臨床保護(hù)力較高的滅活疫苗來控制MS的感染,具體試驗(yàn)結(jié)果如下:為篩選出一株強(qiáng)毒株用于制備滅活疫苗,本研究對(duì)山東省濱州市某養(yǎng)雞場疑似MS感染的氣管棉拭子病料分離純化三代后進(jìn)行了PCR鑒定,將測序后的16S rRNA序列上傳GenBank通過BLAST比對(duì)分析。結(jié)果顯示:疑似MS的分離株在低倍顯微鏡下觀察,菌落呈典型的“荷包蛋”狀;PCR鑒定可擴(kuò)增到特異性條帶;測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)顯示其與MS標(biāo)準(zhǔn)菌株(WVU1853)和河南商丘分離株(CHN-SQ27-2017)的相似性均為99%,證明獲取的CHN-J2-2016分離株為MS。用CHN-J2-2016分離株感染21日齡的雞,攻毒后11天和21天進(jìn)行剖檢,結(jié)果證實(shí)CHN-J2-2016分離株致病性強(qiáng),能引起典型的足墊腫脹及關(guān)節(jié)滑液囊炎,因此可將禽滑液囊支原體CHN-J2-2016強(qiáng)毒株作為滅活疫苗的候選菌株。為了了解禽滑液囊支原體CHN-J2-2016株的生長特性,確定CHN-J2-2016株在疫苗生產(chǎn)工藝中抗原的最佳收獲時(shí)間,制備四種不同佐劑的滅活疫苗。本試驗(yàn)利用支原體活菌數(shù)檢測常用的顏色變化單位(color change units,CCU)、菌落形成單位(Colony forming units,CFU),以及蛋白濃度和核酸含量檢測法檢測108 h內(nèi)CHN-J2-2016株的生長變化并繪制生長曲線。CCU、CFU結(jié)果顯示,CHN-J2-2016株在改良Frey液體培養(yǎng)基內(nèi)12~48 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期,CCU法顯示48 h活菌數(shù)最高可達(dá)10~8 CCU/mL,CFU法顯示48~54 h間的活菌數(shù)最高可達(dá)1.53×10~8CFU/ml;蛋白濃度結(jié)果顯示自6 h開始增長,至48 h達(dá)到最高為390.8 ug/mL;核酸含量結(jié)果顯示自12 h開始增長,循環(huán)值至48 h達(dá)到最高為20.56。因此,可將48~54h作為CHN-J2-2016株疫苗生產(chǎn)工藝中抗原的最佳收獲時(shí)間。大體積培養(yǎng)收獲抗原制備的四種滅活疫苗物理性狀均良好,且能在4℃保存半年。為探討制備的四種滅活疫苗的免疫原性,本試驗(yàn)隨機(jī)選取190只30日齡的雞按10只/組分為19組,所有雞30日齡首次免疫,60日齡再次加強(qiáng)免疫。前9組按組分別皮下免疫四種疫苗與四種佐劑各0.25 mL/只,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組;并于首免后7d至180d內(nèi)每隔7d每組隨機(jī)抽取5只雞翅下靜脈采血測血清抗體。后10組按組分別皮下免疫四種疫苗與四種佐劑各0.25mL/只,同時(shí)設(shè)陰、陽性對(duì)照組。所有試驗(yàn)組及陽性組在首次免疫后42d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn),攻毒后10d和20d每組取5只病雞進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)打分及病理剖檢。血清抗體檢測結(jié)果顯示:不同組在免疫后的抗體水平均呈現(xiàn)不同程度的增長,但只有71R VG+Ag組于首次免疫后血清抗體水平明顯增高,隨后抗體滴度微微下降但仍保持穩(wěn)定。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示攻毒后各免疫組及陽性對(duì)照組在攻毒后均出現(xiàn)不同程度的發(fā)病癥狀,喉頭取樣的棉拭子均能分離出MS;喉頭組織提取DNA后根據(jù)循環(huán)值顯示免疫組喉頭MS定植量要低于對(duì)照組;氣管切片鏡檢顯示攻毒后所有組的氣管粘膜不同程度的增厚,但疫苗組的病變要低于佐劑組;病理剖檢結(jié)果顯示攻毒后氣囊發(fā)病不明顯,但足墊及關(guān)節(jié)均出現(xiàn)不同程度的腫脹及化膿性積液。上述試驗(yàn)結(jié)果證明,四種疫苗都能不同程度的刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體反應(yīng),但只有71R VG+Ag組免疫后既能產(chǎn)生高水平的抗體又具有很好的臨床保護(hù)效力。本研究成功分離鑒定了一支禽滑液囊支原體強(qiáng)毒株作為滅活疫苗的候選菌株,通過對(duì)其生長特性的研究,確定疫苗生產(chǎn)工藝中抗原的最佳獲取時(shí)間為48h并制備了四種滅活疫苗。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示,四種疫苗都能不同程度的刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體反應(yīng),其中71R VG+Ag組的臨床保護(hù)效力最高。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4
【圖文】：

圖 1 低倍鏡下觀察禽滑液囊支原體單菌落（10X）Fig 1 Single colony of MS observed under the low power CHN-J2-2016 株的生化鑒定檢測結(jié)果株能發(fā)酵葡萄糖，不水解精氨酸，不利用尿素 CHN-J2-2016 株的分子學(xué)鑒定檢測結(jié)果SrRNA 基因電泳結(jié)果2-2016 株的 16SrRNA 分子鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增片的片段大小相符（圖 2）。

圖 2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig 2Agarose gel electrophoresis result of PCR pro000Marker；1：陽性對(duì)照；2：陰性對(duì)照；3：CHN-J2-2DNAMarker; 1: positive control; 2: Negative control; 3: PCCHN-J2-2016 strain 擴(kuò)增產(chǎn)物 16sRNA 基因克隆及序列分析結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物的 16SrRNA 基因序列經(jīng)過測序后，擴(kuò)增考株WVU1853及本實(shí)驗(yàn)室分離到的禽滑液囊支的同源性，證實(shí)該分離株 MS。囊支原體 CHN-J2-2016 株致病性的檢測結(jié)果第 11d 和第 21d 分別進(jìn)行剖檢，結(jié)果表明對(duì)照組好。而攻毒組的病雞逐漸表現(xiàn)出沉郁喜臥、關(guān)節(jié)

Fig 3 Foot-pad lesions of chickens infected with CHN-WF224-2016 isoA：正常雞足墊；B：感染 CHN-J2-2016 株的腫脹足墊；C：足墊有炎性D：關(guān)節(jié)有炎性滲出A: Normal foot pad; B: Swollen food pad infected with CHN-WF224-2016 C: Foot-pad lesion with cloudy fluid; D:Arthritis with cloudy fluid3 討論MS 是一種能夠引起禽群慢性亞臨床性感染的疾病。可經(jīng)蛋垂直經(jīng)呼吸道及外分泌液呈水平傳播[53]，具有發(fā)病率高、死亡率低的傳播原感染后可終身定植于雞體內(nèi)，雖不引起雞群的死亡，但能夠逃避宿疫系統(tǒng)造成免疫抑制從而誘發(fā)多種病原的繼發(fā)感染。MS 自 1954 年以來，逐漸呈世界性分布[54]。在歐美等一些發(fā)達(dá)國家，根據(jù)其流行病表明其陽性檢出率甚至要高于 MG。在我國，自 2008 年以來，MS 感趨勢逐年增加，尤其是近兩年，在我國一些養(yǎng)禽業(yè)大省 MS 的感染呈爆

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 宋戰(zhàn)勝;;雞滑液囊支原體病發(fā)病情況調(diào)查及診治[J];中國家禽;2009年12期

2 謝志勤,謝芝勛,龐耀珊,鄧顯文,劉加波;應(yīng)用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測雞毒支原體、雞滑液囊支原體和禽衣阿華支原體的研究[J];畜牧與獸醫(yī);2000年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 朱鴻飛;CpG寡核苷酸對(duì)畜禽疫苗免疫增強(qiáng)作用的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

本文編號(hào)：2751142