【摘要】：色素沉積包括黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素和黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)到周圍角質(zhì)形成細(xì)胞這兩個(gè)過程。色素沉積過程復(fù)雜,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因和microRNAs調(diào)控該過程。前期對(duì)不同毛色羊駝皮膚microRNAs的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)microRNA-5110呈差異表達(dá),可能與毛色形成相關(guān)。本研究通過生物信息學(xué)分析,靶基因驗(yàn)證,microRNA-5110調(diào)控黑色素生成和轉(zhuǎn)運(yùn)的研究,運(yùn)用雙熒光報(bào)告試驗(yàn),熒光定量PCR試驗(yàn),蛋白免疫印跡試驗(yàn),組織免疫化學(xué)與細(xì)胞免疫化學(xué)試驗(yàn),原位雜交試驗(yàn)及深度測(cè)序試驗(yàn),揭示microRNA-5110在黑色素沉積機(jī)制的調(diào)控作用。試驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下:1.運(yùn)用miRBase和TargetScan靶基因生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)microRNA-5110的靶向基因有Wnt1和MLPH,經(jīng)靶基因3'-UTR雙熒光報(bào)告載體和microRNA-5110過表達(dá)載體在293T細(xì)胞中共表達(dá)后,雙熒光素的活性分別為對(duì)照組的0.53倍和0.42倍。因此,推測(cè)Wnt1和MLPH為microRNA-5110的兩個(gè)靶向基因。2.在羊駝黑色素細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染microRNA-5110后,經(jīng)real-time PCR和western blotting方法檢測(cè)microRNA-5110轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞后靶基因Wnt1、MLPH,主要色素調(diào)控基因MITF、TYR、TYRP1、TYRP2,與黑色素顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因Rab27a、Myosin Va的mRNA,蛋白水平以及黑色素含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,microRNA-5110過表達(dá)下調(diào) Wnt1、MLPH、MITF、TYR、TYRP1、Rab27a 和 Myosin Va 基因 mRNA 表達(dá),而上調(diào) TYRP2mRNA 表達(dá);microRNA-5110 過表達(dá)下調(diào) Wnt1、MLPH、MITF、TYR、TYRP1、Rab27a和Myosin Va蛋白水平,但是TYRP-2蛋白水平相對(duì)上調(diào);microRNA-5110過表達(dá)引起總黑色素含量和褐黑素含量明顯下調(diào),真黑色素含量明顯上調(diào)。因此,推測(cè)microRNA-5110參與黑色素形成和轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控。3.建立microRNA-5110轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞后,Fontana-Masson染色發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒明顯減少;皮下注射microRNA-5110過表達(dá)載體后,小鼠毛色表型變淺。microRNA-5110轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中MITF、TYR、TYRP1、Rab27a 和 MyosinVa 基因 mRNA 表達(dá)低于正常組小鼠,TYRP2 mRNA高于對(duì)照組:microRNA-5110轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2蛋白水平低于對(duì)照組,microRNA-5110轉(zhuǎn)基因小鼠總黑色素和褐黑色素含量明顯低于對(duì)照組,而真黑色素含量明顯高于對(duì)照組。因此,推測(cè)microRNA-5110參與動(dòng)物毛色形成和轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控。4.為了盡可能的發(fā)現(xiàn)黑色素顆粒合成和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,對(duì)過表達(dá)microRNA-5110的黑色素細(xì)胞進(jìn)行了深度測(cè)序。結(jié)果顯示:四個(gè)分子路徑即黑素原生成途徑,MAPK途徑,Wnt信號(hào)途徑和cAMP信號(hào)途徑表達(dá)差異。其中有48個(gè)為上調(diào)基因,212個(gè)基因?yàn)橄抡{(diào)基因。熒光定量分析 DKK1,gp10O,IGF1R,CDK5,Ednrb,Kitl,Myc 和 sGC 的 mRNA表達(dá)差異及MAPK信號(hào)通路mRNA表達(dá)差異,其結(jié)果與RNA測(cè)序結(jié)果相一致。5.運(yùn)用real time PCR,western blotting及組織免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)cAMP信號(hào)途徑中鳥氨酸環(huán)化酶(sGC)在白色與黑色綿羊皮膚中的表達(dá)差異。結(jié)果顯示,sGC mRNA和蛋白在黑色綿羊皮膚中的表達(dá)量顯著低于白色綿羊皮膚;組織免疫化學(xué)結(jié)果顯示:在白色綿羊皮膚中sGC陽性反應(yīng)分布在毛乳頭上方;在黑色綿羊皮膚中sGC陽性反應(yīng)分布在毛乳頭及外根鞘。pGLO-sGC轉(zhuǎn)染綿羊黑色素細(xì)胞后,MITF,TYR,TYRP1和TYRP2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)。結(jié)論:microRNA-5110通過靶向結(jié)合Wnt1和MLPH調(diào)控毛色基因MITF,TYR,TYRP1和TYRP2以及轉(zhuǎn)運(yùn)基因MyosinVa和Rab27a的表達(dá)而影響小鼠毛色表型變化。microRNA-5110在黑色素細(xì)胞中參與多條信號(hào)路徑,其中sGC是潛在的被調(diào)控基因之一,在黑色素細(xì)胞中受microRNA-5110的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S813.1
【圖文】：

１黑色素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞逡逑表皮內(nèi)的黑色素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞以接近１：１０的比例存在并進(jìn)行黑色素顆粒的逡逑分配（圖１－１）。在ＪＨ常情況下，位于表皮基底層的黑色素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞是一個(gè)增殖逡逑及其緩慢的穩(wěn)定種群，但是表皮上層的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖是相對(duì)迅速的。向上的壓力逡逑將角質(zhì)形成細(xì)胞連同角質(zhì)形成細(xì)胞攝入的黑色素顆粒推向皮膚的表面形成－種臨界屏逡逑障，從而使有機(jī)體抵御來自環(huán)境的ＩＥ力。因此，不僅是黑色素細(xì)胞內(nèi)的黑色素顆粒，還逡逑有與位于淺表層的角質(zhì)形成細(xì)胞的相互作用，從而賦予了皮膚特征性顏色。盡管在身體逡逑不同位置的黑色素細(xì)胞（比如毛囊、眼睛、內(nèi)耳等）與周圍細(xì)胞的相互作用方式不同于表逡逑皮方式，但是參與產(chǎn)生黑色素顆粒所涉及的基本過程和合成黑色素顆粒的細(xì)胞器（稱為逡逑黑素體）是相似的。逡逑ｌ邋＊邋＾邋＼邐＼邐９逡逑圖１－１黑色素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞模式圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ邋ａｎｄ邋ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ逡逑－３－逡逑

虻牡鞍姿釘夥從κ頭牛危錚簦悖璧幕钚園閬誚峁褂潁]3?（ＮＩＣ），其隨后易位到細(xì)胞核內(nèi)與ＲＢＰ－Ｊ轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生反式激活復(fù)合物所得的轉(zhuǎn)錄逡逑激活復(fù)合物促進(jìn)各種靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括Ｈｅｓ基因的成員和Ｈｅｙ基因家族（圖１－４）。這逡逑些核內(nèi)蛋白質(zhì)對(duì)系譜特定性基因的表達(dá)具有反作用，比如Ａｓｃｉｉ，邋ＭｙｏＤ，邋Ａｔｏｈｌ和Ｅ２Ａ，逡逑從而維持細(xì)胞的未分化狀態(tài)ｔ１４＃。逡逑ｌｂ邐罐一逡逑Ｉ邐ｔ－ｅ＾ｃＥ逡逑§邐ｖ－ｓ？ｃｒ＾ａｓ８逡逑（ｈｋ）ｔｃｈ邐１邋Ｇ0Ｊ0？邋少逡逑ＣＺ２ＨＺＤ逡逑ＣｙｔＣＨ＾ｍ逡逑■佊．邋ｉ聯(lián)腿灥Ｅ壚ｆｆｉ

本文編號(hào)：2750767