【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染導(dǎo)致多種豬圓環(huán)病毒2型相關(guān)疾病(PCVAD),給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。疫苗接種是預(yù)防PCVAD最經(jīng)濟有效的方法。隨著免疫壓力的加大,PCV2病毒在快速進化,而現(xiàn)有商業(yè)化PCV2疫苗的疫苗株均是PCV2a或者PCV2b基因型,其對臨床占主導(dǎo)地位的PCV2d毒株的防控效果存有爭議。因此研發(fā)廣譜、高效的PCV2新型疫苗尤為重要。本研究從豬圓環(huán)病毒2型流行病學(xué)調(diào)查、新型疫苗研制以及疫苗效果快速評估方法的建立等方面入手,以期為PCVAD的防控提供必要工具。獲得的結(jié)果如下:1.于2016-2018年間從全國65家豬場的217份臨床樣本中,分離獲得48株P(guān)CV2毒株,測定其基因組序列并進行PCV2遺傳變異與進化分析。48株P(guān)CV2毒株中PCV2a、PCV2b與PCV2d占比分別為4/48、13/48和31/48。其中,PCV2d亞型在2016年、2017年和2018年占比分別為54.5%、65.2%和71.4%,表明PCV2d亞型在我國逐年增加,并占有優(yōu)勢地位。48株P(guān)CV2毒株的基因序列同源性為93.4%-100%。RDP 4.0軟件分析分離的48株P(guān)CV2毒株,未見重組事件。PCV2d的主要抗原表位(~(43)D/G、~(115)D/G、~(134)N/T、~(165)P/T、~(169)G/R/S、~(210)E/G/D)存在較高的氨基酸殘基多樣性。仔豬攻毒PCV2d HeB-1株后14、21d血清中病毒滴度均高于PCV2b LN-3株,但差異不顯著(p0.05)。攻毒仔豬的腹股溝淋巴結(jié)中PCV2抗原的含量在PCV2d HeB-1株和PCV2b LN-3株之間無明顯差異。2.將PCV2 HeB-1株的ORF2基因與分子佐劑—補體C3d-P28進行融合,開發(fā)出一種新型PCV2 DNA疫苗(pVOC3)。pVOC3疫苗免疫仔豬后攻毒,可顯著減少仔豬血清中PCV2b或PCV2d的病毒拷貝數(shù),產(chǎn)生較高的PCV2特異性抗體,并刺激PCV2特異性干擾素γ分泌細胞的產(chǎn)生,與未加C3d-P28佐劑的試驗組(pVO)差異顯著(p0.05)。3.利用馬賽克T-細胞疫苗設(shè)計軟件獲得PCV2病毒的馬賽克Cap蛋白,其對66條參考PCV2 Cap蛋白具有較好的表位覆蓋,與PCV2 HeB-1株、PCV2 LN-3株和PCV2LG株的同源性分別為98.3%、97.0%、91.8%。馬賽克Cap蛋白誘騙表位(169-180aa)用Pan DR T輔助細胞表位替換,獲得一個改構(gòu)馬賽克Cap蛋白。以PCV2 HeB-1基因組為骨架,將其Cap蛋白基因用優(yōu)化的改構(gòu)馬賽克Cap蛋白基因進行替換,新設(shè)計的PCV2病毒基因組全基因合成后進行真核表達載體構(gòu)建、PK-15細胞轉(zhuǎn)染及篩選,獲得一株新型PCV2毒株,命名為馬賽克PCV2 SD株。馬賽克PCV2 SD株制成疫苗免疫小鼠,小鼠血清中檢測不到誘騙抗體,且與PCV2 HeB-1免疫組相比,血清中和抗體水平提高1.6倍以上。4.將含豬干擾素-γ基因(PoIFN-γ)的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細胞,獲得一株可穩(wěn)定表達PoIFN-γ的PK-15細胞系,命名為PK15-PoIFN-γ細胞系。PK15-PoIFN-γ細胞可顯著增強馬賽克PCV2 SD株的增殖效率,病毒毒價達1×10~(8.4) TCID_(50)/mL以上,且連續(xù)傳15代后對病毒的增殖無影響。5.改構(gòu)馬賽克Cap蛋白經(jīng)密碼子優(yōu)化后成功實現(xiàn)大腸桿菌高效表達。改構(gòu)馬賽克Cap蛋白與Gel 01ST佐劑乳化制備成疫苗并免疫仔豬,免疫后14d仔豬血清中即可檢測到PCV2特異性抗體,攻毒后仔豬未檢測到病毒血癥,組織病理變化輕微,腹股溝淋巴結(jié)中PCV2病毒含量很低,PCV2特異性IFN-γ-SC的數(shù)量顯著增加,與攻毒對照組相比差異顯著(P0.05)。同時,改構(gòu)馬賽克Cap蛋白亞單位疫苗對PCV2d HeB-1株、PCV2b LN-3株均能達到保護效果。6.改構(gòu)馬賽克Cap蛋白與佐劑乳化后免疫小鼠制備單克隆抗體,獲得15株單抗并完成其中4株單抗(2C5、4G7、5F7、6F8)的鑒定。4株單抗均與改構(gòu)馬賽克Cap蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),與PCV2病毒產(chǎn)生特異性的免疫熒光信號,且與CSFV、PRRSV、PRV、PPV等豬常見病毒無特異性反應(yīng)。單抗6F8、2C5為PCV2的中和性抗體,其中單抗6F8對PCV2病毒各基因型均有中和活性,而單抗2C5僅對PCV2d亞型毒株有中和活性。7.以PCV2中和單抗6F8為基礎(chǔ),制備了一種PCV2血清中和抗體阻斷ELISA試劑盒。以血清中和抗體檢測試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),PCV2血清中和抗體阻斷ELISA試劑盒的檢測敏感性為98.9%,特異性為78.9%,與細胞中和試驗的符合率為93.3%,批內(nèi)批間變異系數(shù)小于10%,可4℃保存1年以上。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4
【圖文】：

圖 2-3 PCV2b 或 PCV2d 攻毒后仔豬血清中 PCV2 的含量Fig.2-3 PCV2 DNAin sera after challenge of pigs with PCV2b or PCV2圖 2-4 仔豬淋巴結(jié)中 PCV2 抗原的免疫組化檢測結(jié)果unohistochemical detection of PCV2 antigen in the lymph nodes of expCV2b 的抗原檢測 B：攻毒 PCV2b 組的抗原檢測 C：攻毒 PCV2dntigen was detected from the control group. (B) PCV2b antigen was deh PCV2b strain. (C) PCV2d antigen was detected in the inguinal lymphchallenged with PCV2d strain.

圖 2-4 仔豬淋巴結(jié)中 PCV2 抗原的免疫組化檢測結(jié)果Fig.2-4 Immunohistochemical detection of PCV2 antigen in the lymph nodes of experimental pigsA：對照組 PCV2b 的抗原檢測 B：攻毒 PCV2b 組的抗原檢測 C：攻毒 PCV2d 組的抗原檢測A： PCV2b antigen was detected from the control group. (B) PCV2b antigen was detected from pigschallenged with PCV2b strain. (C) PCV2d antigen was detected in the inguinal lymph nodes from pigschallenged with PCV2d strain.2.3 討論PCV2 是 PCVAD 的主要病原體，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，對其進行系統(tǒng)的流行病學(xué)監(jiān)測具有重要意義。目前，已報道的 PCV2 病毒分為 5 種基因型，分別以 PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e 等命名。2009 年至 2010 年間，PCV2的主要基因型從 PCV2a 向 PCV2b 轉(zhuǎn)變，2010 年以后，PCV2d 基因型成為世界的主要流行基因型(Cai et al. 2012; Guo et al. 2010)。PCV2 基因型的轉(zhuǎn)變可能受到疫苗免疫壓力的影響。Reiner 等對免疫 PCV2 疫苗(基于 PCV2a )的豬場和未免疫 PCV2 疫苗的豬場中分離病毒的 PCV2a 和 PCV2b 基因型占比進行了研究，結(jié)果表明 PCV2a 占比從

圖 3-1 重組質(zhì)粒 PVAX1-ORF2 和 PVAX1-ORF2-C3d-P28.3 的構(gòu)建Fig. 3-1 Construction of the plasmids PVAX1-ORF2 and PVAX1-ORF2-C3d-P28.3A：質(zhì)粒設(shè)計圖 B：質(zhì)粒酶切圖譜A：Construction of the two plasmids B：Restriction digest of the two plasmidspVAX1-ORF2 和 pVAX1-ORF2-C3d-P28.3 轉(zhuǎn)染 PK-15 細胞后，均可見特異性免疫熒光，PCV2 ORF2 基因在 PK-15 細胞中實現(xiàn)了體外表達(圖 3-2 )。A B CPVAX1-ORF2PVAX1-ORF2-C3d-P28.3 ORF2Nhe IC3d-P28 C3d-P28 C3d-P28Hind IIIGGGGSGGGGSLINKERORF22000bp750bp250bp5000bp1000bp250bp

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本文編號：2750651