發(fā)布時(shí)間：2020-07-11 16:05

【摘要】：發(fā)情鑒定的準(zhǔn)確性是影響水牛的繁殖性能的重要因素。生產(chǎn)中大約有50%左右的水牛發(fā)情現(xiàn)象不能被準(zhǔn)確監(jiān)測(cè),導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)了最佳配種時(shí)間,造成經(jīng)濟(jì)損失。因此,篩選一種簡(jiǎn)單可行的鑒定水牛發(fā)情的方法,對(duì)水牛生產(chǎn)和繁育具有重要意義。本研究以非侵入性的體液(唾液)作為試驗(yàn)材料,對(duì)成年母水牛整個(gè)發(fā)情周期的血液和唾液激素變化,發(fā)情期唾液結(jié)晶變化與卵巢卵泡發(fā)育進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析;以蛋白定量技術(shù)(iTRAQ,isobaric tags for relative and absolute quantitation)分析了不同發(fā)情期的差異蛋白并進(jìn)行驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:1.水牛唾液和血液發(fā)情周期生殖激素的變化規(guī)律。本研究采用酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)分別對(duì)水牛整個(gè)發(fā)情周期的唾液和血液的生殖激素水平變化規(guī)律進(jìn)行測(cè)定:水牛血液和唾液中的E2和P4呈波動(dòng)性變化,發(fā)情前期,唾液中P4濃度一直維持在6.5～7.1ng/mL,第13天達(dá)到峰值,隨后快速下降。唾液中E2濃度在發(fā)情前期第3～5天出現(xiàn)一個(gè)峰值,在14～17d唾液中E2濃度顯著升高,出現(xiàn)第二個(gè)峰值。唾液E2和P4濃度的變化趨勢(shì)和血清E2和P4濃度的變化趨勢(shì)基本一致。母水牛唾液E2和P4濃度相關(guān)性極顯著相關(guān)(R=0.7754,P0.01),母水牛唾液和血清標(biāo)本的FSH濃度相關(guān)性顯著(R=0.3471,P0.05)。2.發(fā)情周期唾液結(jié)晶幾何結(jié)構(gòu)分析。水牛發(fā)情周期唾液表現(xiàn)為蕨類(lèi)植物形態(tài),樹(shù)枝樣形態(tài),松針樣形態(tài),圓點(diǎn)型,樹(shù)枝型-蕨類(lèi)植物結(jié)合型等多種形態(tài);發(fā)情當(dāng)天可見(jiàn)典型的蕨類(lèi)植物形態(tài)和樹(shù)枝樣形態(tài)。經(jīng)B超同步檢測(cè)卵巢上卵泡的發(fā)育情況發(fā)現(xiàn),典型的唾液結(jié)晶形態(tài)與發(fā)情當(dāng)天卵巢上優(yōu)勢(shì)卵泡的發(fā)育相一致,且唾液結(jié)晶的分形幾何分析得出,發(fā)情當(dāng)天分形維值最低。3.水牛唾液生殖激素、唾液結(jié)晶和卵泡變化進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。水牛發(fā)情當(dāng)天唾液雌激素的水平為240.16±32.92pg/mL,達(dá)到一個(gè)峰值,隨后開(kāi)始緩慢的降低。水牛唾液中孕激素水平在發(fā)情前48小時(shí)達(dá)到了 16.50±5.82ng/mL,發(fā)情當(dāng)天降低到8.95±7.50ng/mL。水牛發(fā)情階段LH在發(fā)情前24小時(shí)逐漸下降,激素水平從6.05 ±0.81 ng/mL到3.95士2.06ng/mL;但在發(fā)情后12小時(shí)后逐漸升高,達(dá)到6.22±1.68ng/mL。FSH激素水平基本比較平穩(wěn),變化不大。B超監(jiān)測(cè)卵巢卵泡卵泡從發(fā)情前2天迅速生長(zhǎng),到發(fā)情當(dāng)天達(dá)到20mm左右,卵泡的大小直到破裂排卵變化不顯著。排卵后形成的黃體,黃體期一直維持到下次發(fā)情前四天左右,期間在發(fā)情后14～17天黃體的最大,與前面得出的水牛唾液中促黃體激素分泌峰一致。并對(duì)并對(duì)唾液結(jié)晶方法、直腸檢查法、唾液結(jié)晶+B超、直腸檢查+B超四種方法進(jìn)行了生產(chǎn)中的驗(yàn)證,得出唾液結(jié)晶+B超的發(fā)情率最高,妊娠率比其他組高,但差異不顯著。4.選取發(fā)情周期水牛的唾液作為試驗(yàn)材料,采用iTRAQ蛋白質(zhì)組定量技術(shù)鑒定水牛發(fā)情周期的差異蛋白表達(dá)。共鑒定1160個(gè)蛋白質(zhì),VENN圖對(duì)發(fā)情周期的不同階段的組別(間情期:發(fā)情前期;間情期:發(fā)情期;間情期:發(fā)情后期;間情期:發(fā)情前期+發(fā)情期+發(fā)情后期)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),這四個(gè)組有105個(gè)共有蛋白,發(fā)情期與間情期組有87特有差異蛋白。所有鑒定到的蛋白分別參與到了 7個(gè)代謝通路中,參與蛋白數(shù)量最多的通路是唾液分泌,應(yīng)用生物學(xué)信息分析軟件進(jìn)行了差異蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作分析。發(fā)情期與間情期組的差異蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)共有297個(gè)點(diǎn),形成的兩兩互作關(guān)系有1272個(gè),顯示最高的基因是“ENO1”。5.采用免疫印跡法對(duì)水牛發(fā)情周期篩選的差異蛋白SERPRINA1、ANNEXIN、HSP-70、ENDOU 進(jìn)行了驗(yàn)證。驗(yàn)證的蛋白中 SERPRINA1、ANNEXIN、HSP-70 蛋白在發(fā)情期唾液中的表達(dá)量的比間情期、發(fā)情前期和發(fā)情后期這三個(gè)發(fā)情階段的變化明顯提高。ENDOU(PP11)蛋白的表達(dá)量在發(fā)情前期升高,發(fā)情期降低。驗(yàn)證蛋白的變化趨勢(shì)和蛋白組學(xué)研究結(jié)果相一致。不同水牛的SERPRINA1、ANNEXIN、HSP-70三個(gè)蛋白驗(yàn)證結(jié)果與上述結(jié)果也一致,ANNEXIN、HSP-70可能作為后續(xù)試劑盒開(kāi)發(fā)的候選蛋白用于后續(xù)的研究。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S823.83
【圖文】：

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與其他體內(nèi)標(biāo)記和非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)相比，ｉＴＲＡＱ技術(shù)具有的優(yōu)點(diǎn)如下：逡逑１）高靈敏度，可檢測(cè)出較低豐度蛋白，胞漿蛋白，膜蛋白，核蛋白等；２）分離能力逡逑強(qiáng)，葉分離出小■�。垮澹保埃嘶蛘叽笥冢玻埃埃穗y溶性的酸性或堿性蛋白；３）高通Ｍ，可同時(shí)逡逑對(duì)處理方式不同的８?jìng)�(gè)樣品進(jìn)行差異蛋白分析（王文文，２０１６）邋；邋４）可Ｎ時(shí)得出準(zhǔn)確逡逑可靠的鑒定和定量結(jié)果。重復(fù)樣品間蛋白的表達(dá)量相關(guān)性可達(dá)到０．９５以ｈ。５）邋ＬＣ和逡逑ＭＳ／ＭＳ連用，適用于任何類(lèi)型的樣本，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，分離純化效果好，分析速逡逑度快（龐琪，２０１６）。但要求必須有可供參考的數(shù)據(jù)祚、轉(zhuǎn)錄ｍ或基閑組注釋信息提供。逡逑

本試驗(yàn)對(duì)觀(guān)察到的發(fā)情牛只進(jìn)行了整個(gè)發(fā)情周期唾液樣品的采集，對(duì)８頭母水牛的逡逑唾液樣品連續(xù)采集２個(gè)發(fā)情周期以上進(jìn)行研究，我們對(duì)水牛整個(gè)發(fā)情周期的３２７個(gè)樣品逡逑的唾液結(jié)晶模型進(jìn)行了分析，下面為其中１個(gè)發(fā)情周期２４天的唾液結(jié)晶圖（如圖３－２逡逑所示），從唾液結(jié)晶圖形中可以觀(guān)察到在發(fā)情當(dāng)天（ＤａｙＯ）為典型的蕨類(lèi)植物結(jié)晶圖形逡逑和第１９天為典型的樹(shù)枝狀結(jié)晶圖形。逡逑３６逡逑

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本文編號(hào)：2750620